microRNA-30b通过调节细胞凋亡参与调控糖尿病心肌病机制的研究

发布时间：2020-08-23 12:45

【摘要】：研究背景及意义糖尿病属于一类代谢异常疾病,可以由不同原因引起,临床表现为慢性高血糖。随着生活水平不断提高、老龄化不断加重、诊断方法不断进步,糖尿病的发病率越来越高,已经发展成为第三大非传染病,位于心血管及恶性肿瘤后。糖尿病晚期阶段,易合并一些别的器官组织损伤且不易治愈。经常发生的糖尿病并发症包括糖尿病足、糖尿病性心脏病、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、呼吸道感染、泌尿道感染等。糖尿病对心脏的损害表现为多个方面,其中对冠状动脉粥样硬化性心脏病而言,糖尿病是冠状动脉疾病的一个主要的独立危险因子。与非糖尿病患者相比,糖尿病患者冠心病发病时间更早,尤其是在肾病并存时;不典型心绞痛更常见;心肌梗死的死亡率更高。而糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病心脏并发症的一种,属于特异性疾病,患者多有5年以上糖尿病病史,且诊断过程中已经排除高血压病、冠状动脉粥样硬化性心脏病等其他疾病引起的心肌损伤。糖尿病心肌病的一般病理特征涉及细胞及细胞间质,心肌细胞方面常见肥大、坏死、凋亡、心肌纤维的减少,细胞间质方面的改变常见心肌间质的弥漫性纤维化,微小血管可以出现基底膜增厚、微动脉瘤、基质增加等改变;电镜检查可以发现心肌细胞内结构等受到明显损害,其中线粒体的改变很明显,包括核周围线粒体增多,线粒体肿胀等,另外线粒体周围糖原和脂滴较正常时明显聚集。而血糖升高可引起的包括自主神经的病变、微循环功能的障碍、代谢或能量改变,以及晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)聚集增加等一系列的生理或代谢异常,与上述病理改变一起均参与了糖尿病心肌病的发生。在起始阶段并没有症状发生,随着疾病发展,逐渐出现心力衰竭,首先表现为舒张性心力衰竭,其射血分数正常,然后出现收缩性心力衰竭,其射血分数降低。糖尿病合并心脏病已成为当代医学危险最高的疾病组合之一,同时糖尿病心肌病的发病率和死亡率不断急速升高,需进一步针对DCM进行研究,目前研究多关注于在心肌代谢异常、受体信号通路改变等病生异常,心肌代谢异常包括了氧化应激反应(Oxidative Stress,OS)增加、终末化糖基产物(AGEs)形成增多等。由高糖毒性产物介导的多种细胞信号通路包括了炎症信号通路、蛋白激酶C(PKC)通路、及丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路等。除此之外,细胞凋亡对心脏结构和功能的损伤是糖尿病心肌病发生发展的重要环节。细胞凋亡是一种细胞的程序性死亡,在各种内外因素作用下,细胞内特定程序被启动,经过多途径的信号传导,最后激活内源性DNA内切酶,导致了细胞自然死亡。目前找到的与细胞凋亡机制相关的包括细胞色素C(Cytc)、P53、Bcl-2、Caspase-3等,其中Bd-2为抑制凋亡成分,Caspase-3为促进凋亡成分。MicroRNA(miRNA)是一种非编码单链RNA,长度为22-23个碱基,它通过结合于靶mRNA的3'-UTR,影响mRNA翻译或者直接讲解。很多研究发现,在机体的很多种生命活动中,均有miRNA的参与,包括细胞增殖、分化、凋亡、组织发育等。另有研究发现,心肌细胞中的miRNAs表达上调可能参与了心室重构、心肌肥厚、离子通道表达、自噬等一些病理生理过程。进一步有学者指出,micro RNA出现在胰岛素抵抗时心脏病变过程中。从以上得出,microRNA可能在糖尿病心肌病发生发展过程中起着非常重要作用。有研究表明,miR-30c通过调控Beclin蛋白表达参与糖尿病心肌病过程。miR-30b是miR-30族的的一员,位于人第8号染色体,在肿瘤发生、线粒体分裂和细胞凋亡过程中发挥着重要的调节作用,但是miR-30b在糖尿病心肌病中作用,至今未见相关报道。这给我们提示,miR-30b在DCM心肌细胞中表达如何?如果表达异常,它是否参与了糖尿病心肌病的致病过程?本研究通过结合生物信息学和分子生物学实验探索了 miR-30b在糖尿病心肌病中的作用和潜在的分子机制,为其在糖尿病心肌病中的应用奠定理论基础,同时为糖尿病心肌病治疗发掘新的药物靶点。本研究共分为四个部分,第一部分,通过造模制备大鼠糖尿病心肌病模型和对照组,采用微小RNA芯片高通量筛选差异表达miRNAs,并采用qRT-PCR验证;第二部分,用高浓度糖培养H9C2心肌细胞,然后测定高浓度糖对心肌细胞凋亡率、促细胞凋亡因子和细胞凋亡抑制因子表达水平、miRNA-30b的mRNA水平的影响;第三部分,采用转染技术干扰心肌细胞中miRNA-30b的表达,观察干扰miRNA-30b表达对心肌细胞凋亡、细胞凋亡因子和细胞凋亡抑制因子表达水平的影响;第四部分,采用微小RNA数据库Target Scan预测miRNA-30b潜在靶基因,观察miRNA-30b mimic转染对靶基因mRNA水平和蛋白表达的影响,进一步用荧光素酶报告基因技术验证miRNA-30b的靶基因。第一部分糖尿病心肌病大鼠心肌组织中微小RNA的聚类分析研究目的:1.探索糖尿病心肌病大鼠模型的基本情况及形态变化;2.探索糖尿病心肌病大鼠中差异表达的miRNAs并验证。研究方法:1.将实验大鼠分为糖尿病心肌病组、对照组,通过超声心动图、苏木精-伊红染色法测定糖尿病心肌病大鼠模型是否构建成功;2.分析DCM组与对照组大鼠心肌组织中miRNA表达谱,筛选出差异表达的miRNAs;3.使用qRT-PCR测定miR-30b在DCM组和对照组大鼠心肌组织中的表达水平。研究结果:1.DCM 组的 A 值、EDT(Edeceleration time)、EDT'、IVRT(Isovlumic relaxation time)和IVRT'显著高于对照组,E值、EF(Ejectionfraction)、E/A低于对照组,HE染色中,与对照组相比,DCM组大鼠心肌细胞排列疏松紊乱,细胞核大小不一,有少量坏死灶充斥在间质结构中;2.在DCM组大鼠心肌组织中182个miRNAs与对照组大鼠心肌组织相比存在差异表达,其中上调最显著的miRNA为miR-30b;3.miR-30b在DCM组大鼠心肌组织中的表达与对照组大鼠心肌组织相比显著上调。结论:miR-30b表达在DCM大鼠中上调,提示miR-30b参与了 DCM的发生发展过程。第二部分高浓度糖诱导心肌细胞上调miRNA-30b及细胞凋亡研究目的:1.探究高糖对大鼠心肌细胞凋亡的影响及机制;2.探究高糖对miRNA-30b表达的影响。研究方法:1.将实验心肌细胞分为正常组、高糖组,并采用流式细胞仪分析各组心肌细胞凋亡情况;2.采用蛋白印迹法测定各组心肌细胞中细胞凋亡相关因子半胱天冬酶-3(Caspase-3)和DNA修复酶PARP以及细胞凋亡抑制因子B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)的蛋白表达;3.采用qRT-PCR检测技术测定正常组和高糖组大鼠心肌细胞H9c2中miRNA-30b的表达情况。研究结果:1.高糖组中,大鼠心肌细胞的早期细胞凋亡率随着高糖处理的时间增加而显著增加,对照组没有显著差异;2.随着高糖处理时间的增加,高糖组细胞凋亡相关因子Caspase-3和PARP的蛋白表达明显增加,而细胞凋亡抑制因子Bcl-2的蛋白表达明显减少,对照组没有显著差异;3.高糖组中,miRNA-30b的mRNA表达随着高糖处理的时间增加而显著增加,对照组无显著差异。结论:高糖能够通过增加细胞凋亡因子水平、降低细胞凋亡抑制因子水平促进心肌细胞凋亡,并能够增加miRNA-30b的表达水平。第三部分抑制miRNA-30b的表达降低大鼠心肌细胞的凋亡研究目的:探索miRNA-30b表达对大鼠心肌细胞凋亡的影响。研究方法:1.将实验大鼠心肌细胞通过培养、转染实验,分为正常组、高糖组、高糖+miRNA-30b抑制组和高糖+阴性对照组,并测定每组心肌细胞的凋亡率;2.采用蛋白印迹法测定各组细胞凋亡相关因子Caspase-3和PARP,以及细胞凋亡抑制因子Bcl-2的蛋白表达;研究结果:1.高糖组心肌细胞凋亡率显著高于正常组,高糖+miRNA-30b抑制组心肌细胞凋亡率明显低于高糖+阴性对照组;2.高糖组Caspase-3和PARP的表达水平显著高于正常组,而高糖+miRNA-30b抑制组的表达显著低于高糖+阴性对照组;高糖组Bcl-2的表达水平显著低于正常组,而高糖+miRNA-30b抑制组的Bcl-2表达显著高于高糖+阴性对照组。结论:高糖处理能够通过提高细胞凋亡因子表达水平、降低细胞凋亡抑制因子表达促进心肌细胞凋亡,而通过转染miRNA-30b抑制剂降低miRNA-30b表达后,能显著降低心肌细胞的凋亡率。第四部分miRNA-30b负性调控Bcl-2的表达研究目的:探究Bcl-2是否为miRNA-30b的靶基因。研究方法:1.利用生物信息学预测miRNA-30的潜在靶基因;2.采用qRT-PCR、蛋白印迹法测定转染miRNA-30b mimic对靶基因mRNA水平和蛋白表达的影响;3.进一步用荧光素酶报告基因技术验证miRNA-30b和靶基因之间的关系。研究结果:1.Target Scan(http://www.targetscan.org/)预测凋亡抑制因子 Bcl-2 是 miR-30b的潜在靶基因;2.转染miRNA-30b mimic能够降低Bcl-2 3'UTR wt的荧光素酶活性;3.转染miRNA-30b mimic能够降低Bcl-2的mRNA及蛋白表达水平。结论:Bcl-2为miRNA-30b的靶基因,miRNA-30b能够通过负向调控Bcl-2的表达发挥其在DCM中的作用。综合结论:糖尿病心肌病时,miRNA-30b表达水平上调,并可通过对靶基因Bcl-2的负性调控作用促进心肌细胞凋亡,参与了 DCM的发生发展过程。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R587.2;R542.2
【图文】：

图２对照组，ＤＣＭ组的大鼠心肌组织中总ＲＮＡ的电泳图，Ｉ泳道为对照逡逑

图３邋ＤＣＭ组与对照组大鼠心肌组织中ｍｉＲＮＡｓ表达谱的聚类分析逡逑与对照组相比，ＤＣＭ组大鼠心肌组织中上调最显著的ｍｉＲＮＡ为ｍＲ－３０ｂ，其上调逡逑倍数变化值为２．５。逡逑５５逡逑

图４邋ｍｉＲ－３０ｂ在ＤＣＭ组和对照组大鼠心肌组织中的表达验证逡逑ｍｉＲ－３０ｂ在ＤＣＭ组大鼠心肌组织中的表达与对照组大鼠心肌组织相比显著逡逑上调，差异具有统计学意义（Ｐ＜0．０１）。逡逑

本文编号：2801541