曲美他嗪通过抑制内质网应激发挥心肌保护作用

发布时间：2020-08-28 09:33

　　研究背景:心力衰竭简称心衰(Heart Failure,HF),是指在各种因素的影响下(如缺血缺氧、炎症、负荷过重等)导致心肌损伤,引起心肌结构改变和功能异常,从而导致心脏泵血功能降低而无法满足机体代谢需要的临床综合征。心力衰竭常常是多种心脏疾病(如高血压、冠心病、心肌梗死等)终末阶段的表现,而非一种独立的疾病。心力衰竭患者的临床结局较差,并且死亡率很高,已发展为世界心血管领域的重要公共卫生问题。现阶段人们仍然在积极探索心力衰竭的发病机制,可能与心肌细胞的凋亡及炎症反应密切相关。内质网是体内蛋白质加工、折叠、转运的场所,当缺血缺氧、脂质负荷过重、病毒感染、药物或毒素影响时,会破坏内质网稳态,从而诱发折叠或未折叠的蛋白在腔内聚集或钙离子(Ca~(2+))稳态失衡的状态即内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。当内质网应激反应剧烈或持续时间较长时,会进一步诱发细胞凋亡机制引起细胞死亡。肌浆网钙离子转运ATP酶-2a(SERCA2a)通过参与心肌细胞的钙离子转运维持钙离子稳态来调控心肌细胞收缩与舒张功能。内质网应激时,SERCA2a活性减低或者表达减少引起心肌细胞内钙离子稳态失衡,从而导致心肌细胞收缩功能障碍而发生心力衰竭。曲美他嗪(Trimetazidine,TMZ)是临床上用来治疗心肌缺血的药物。已有大量研究表明,在心肌缺血的患者中,TMZ可以通过减少心肌细胞内自由基的产生从而减弱氧化应激反应、缓解钙超载,继而提高心肌的抗缺氧能力,缩小心肌缺血坏死的面积,起到保护心脏结构与功能的作用。近年来,有相关文献报道,在缺血性心肌病中,TMZ可以通过调节心肌细胞内的钙离子浓度从而维持钙离子稳态的平衡,发挥心肌保护作用。然而在心力衰竭时,TMZ是否可以通过抑制内质网应激保护心肌鲜有报道。因此在本研究中,我们采用异丙肾上腺素(ISO)诱导心力衰竭模型,探讨TMZ是否可以改善小鼠的心功能,并对其中机制进行探索;同时,在体外利用心肌细胞研究TMZ对ISO介导的心肌细胞损伤是否有保护作用,及可能的分子机制。研究方法:1、在体研究:以8周大、雄性C57小鼠作为研究对象,采用ISO诱导心力衰竭模型,并将小鼠随机分为以下六组(每组8只):(1)sham组;(2)TMZ组:TMZ20mg/Kg,灌胃,每天三次;(3)ISO组:30mg/kg每天,皮下注射;(4)ISO+TMZ组;(5)ISO+TMZ+rAAV-siSERCA2a组:小鼠在ISO和TMZ处理前,通过尾静脉注射rAAV-siSERCA2a(1×10~(11)/Kg);(6)ISO+TMZ+rAAV-GFP组:小鼠在ISO和TMZ处理前,通过尾静脉注射rAAV-GFP(1×10~(11)/Kg)。干预2周后,采用心脏超声检查及心导管检查(Millar导管)检测小鼠的心脏形态学及功能学改变。同时,通过免疫组织化学以及免疫印迹方法检测内质网应激反应相关的标记蛋白和SERCA2a蛋白的表达情况。2、体外研究:以H9C2心肌细胞系作为研究对象,采用ISO诱导心肌损伤模型,予以TMZ预处理,观察TMZ在体外是否可以缓解ISO诱导的心肌损伤,并对其中内质网应激通路相关蛋白进行检测。另外,通过予以siSERCA2a沉默SERCA2a的表达,研究SERCA2a在TMZ保护心肌细胞中的作用及具体机制。研究结果:结果表明,经小鼠心脏超声和Millar导管检查,与Sham组相比,ISO组可见小鼠的收缩功能和舒张功能均降低,当给予TMZ干预后,小鼠心功能改善,而在ISO+TMZ+rAAV-siSERCA2a组,此效应明显被抑制,表明TMZ可能通过SERCA2a发挥改善心功能的作用。在TUNEL检测细胞凋亡的实验中,我们观察到ISO可以明显诱导心肌细胞凋亡,而TMZ对于心肌细胞凋亡具有改善作用,且该作用被SERCA2a的沉默所逆转。经免疫印迹方法检测内质网应激标志蛋白GRP78和内质网应激通路上特异性的凋亡相关蛋白CHOP蛋白,结果显示在单独使用TMZ干预时,GRP78蛋白及CHOP蛋白表达与对照组相比无统计学意义,在ISO组中,GRP78蛋白及CHOP蛋白的表达量均有所升高,而TMZ可以降低这两种蛋白的表达量,rAAV-si-SERCA2a干预后,可以抑制TMZ的作用。在体外实验中,经免疫蛋白印迹法检测不同组别中GRP78、CHOP、SERCA2a三种蛋白的表达量,结果显示,与对照组相比,ISO干预明显诱导了GRP78、CHOP蛋白的表达量升高,而SERCA2a蛋白的表达量降低,TMZ干预抑制了ISO的上述效应,而这一作用可以被SERCA2a沉默所阻断。使用流式细胞术检测细胞的凋亡情况,结果显示,ISO可以明显诱导H9C2细胞发生凋亡,而TMZ可以显著缓解H9C2细胞凋亡,且该作用被SERCA2a的沉默所逆转。研究结论:1.在体内研究中,ISO可以明显诱导心力衰竭,包括心脏的形态学改变(心室壁增厚、心脏增大)、血液流变学改变(心室内压力变化速率下降、心室舒张末期压力增高等),同时诱导心肌细胞内质网应激,而TMZ可以明显的抑制ISO所诱导的心力衰竭,并且这一作用可能与SERCA2a表达上调,从而减轻内质网应激有关;2.在体外研究中,ISO干预可以明显的诱导内质网应激,刺激心肌细胞发生细胞凋亡,外源性TMZ可以明显的抑制ISO的上述效应,而这一作用可以被SERCA2a沉默所阻断。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R541.6
【部分图文】：

心肌组织,皮下注射,灌胃,三次

图 1-3 心肌组织 TUNEL 染色。（A）心肌组织 TUNEL 染色。（B）心肌细胞凋亡比sham：即空白对照组；TMZ：TMZ 20mg/Kg，灌胃，每天三次；ISO：30mg/kg 每皮下注射； ISO+TMZ：TMZ（20mg/Kg）灌胃（每天三次）后，皮下注射 ISO；ISO+TMZ+rAAV-siSERCA2a：小鼠在 ISO 和 TMZ 处理前，通过尾静脉注射rAAV-siSERCA2a （1×1011/Kg）；ISO+TMZ+rAAV-GFP：小鼠在 ISO 和 TMZ 处理

统计图,心肌组织,蛋白,皮下注射

图 2-3Western-blot 检测心肌组织的 GRP78 蛋白和 CHOP 蛋白表达量。A.心肌组织磨后，收集蛋白，采用针对 GRP78 和 CHOP 抗体进行 Western-blot 检测的结果。B蛋白表达量的灰度扫描统计图。sham：即空白对照组；TMZ：TMZ 20mg/Kg，灌胃每天三次；ISO：30mg/kg 每天，皮下注射； ISO+TMZ：TMZ（20mg/Kg）灌胃（天三次）后，皮下注射 ISO；ISO+TMZ+rAAV-siSERCA2a：小鼠在 ISO 和 TMZ 处前，通过尾静脉注射 rAAV-siSERCA2a （1×1011/Kg）；ISO+TMZ+rAAV-GFP：小鼠ISO 和 TMZ 处理前，通过尾静脉注射 rAAV-GFP（1×1011/Kg）。*P<0.05 vs. sham；P<0.05 vs. ISO；& P<0.05 vs. ISO+TMZ。2.2.3.2 曲美他嗪通过调节 SERCA2a 抑制体外心肌细胞的内质网应激为了进一步验证上述结果，我们在体外也进行了相对应的研究。使用 Western-b方法检测内质网应激的标志性蛋白 GRP78 和与内质网应激相关的凋亡通路的标志蛋白 CHOP，以及 SERCA2a，用 GAPDH 作为内参照。结果显示（图 2-4），与 con

统计图,蛋白,心肌细胞,细胞

图2-4 Western-blot 检测心肌细胞的 GRP78 蛋白、CHOP 蛋白及SERCA.在对心肌细胞进行相关干预后，收集蛋白，进行 Western-blot 检量的灰度扫描统计图。control：即空白对照组；Lipo 2000：单独使细胞 TMZ：20μM 干预 24 小时；ISO：100nM 干预 24 小时；ISO+TM和 TMZ（20μM）共同干预细胞；ISO+TMZ+ Si-SERCA2a：向细胞干预 24 小时后，加 ISO（100nM）、TMZ（20μM）和共同干预细胞；ISO向细胞转染 Si-SERCA2a 干预 24 小时后，加 ISO（100nM）、TMZ（预细胞。* P<0.05 vs.sham；# P<0.05 vs.ISO；& P<0.05 vs.ISO+TMZ

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