富马酸二甲酯对糖尿病心肌病的保护作用及机制研究

发布时间：2020-09-16 09:48

　　研究背景:糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种由于机体的胰岛素分泌缺陷或其生物作用功能受损或两种异常状态同时存在所导致的、以长期高糖血症和代谢紊乱为特征的代谢性疾病。糖尿病可累及多器官并发展为糖尿病相关并发症。糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病心血管系统最常见的并发症。由于糖尿病心肌病患者体内的糖、脂能量代谢紊乱、微血管病变,引发心肌广泛灶性坏死、组织纤维化,可出现心律失常、心功能下降,甚至发生心力衰竭,因此糖尿病心肌病也是糖尿病患者中死亡率、致残率较高的并发症。防治糖尿病心肌病是目前亟待解决的公共健康问题。氧化应激在DCM的发病机制中起着重要作用。活性氧、活性氮自由基可直接损伤心肌细胞蛋白和DNA,激活炎症反应,诱导细胞凋亡,从而促进DCM病程发展。有动物实验研究表明,应用能够抗氧化应激的药物如萝卜硫素(sulforaphane,SFN)、白藜芦醇(resveratrol)、姜黄素(curcumin)等干预DCM,可以部分逆转糖尿病所致的心功能损害。核因子E2相关因子2(Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)通路是机体抵抗内、外应激刺激的重要防御性信号传导通路。在组织、细胞处于氧化应激状态时,Nrf2激活并上调多种抗炎症、抗氧化基因的转录和表达,被认为是机体防御系统转录调节因子的核心因子之一。已有研究发现,激活并上调Nrf2及下游抗氧化基因的表达可在糖尿病所致心肌损伤过程中发挥心肌保护作用;并在体外实验中发现,Nrf2基因沉默后,抗氧化应激药物对糖尿病诱导的心肌细胞损伤失去保护作用。尽管动物实验证实Nrf2在糖尿病诱发的心肌氧化应激损伤、炎症反应、纤维化改变及细胞凋亡等过程中有保护作用,但进入临床应用的、通过激活Nrf2通路达到心肌保护作用的药物仍然很少。富马酸二甲酯(DMF)又称BG-12,是经美国FDA批准临床应用的治疗成人多发性硬化症的口服药。在人体和动物体内的实验均证实,DMF能够激活Nrf2通路,诱导胞浆内Keap1-Nrf2复合物的解偶联,使Nrf2入核并上调下游抗氧化基因的转录,抵抗自由基、炎性因子、有毒代谢物等对细胞的损伤,具有良好的抗氧化应激作用。由于氧化应激及其对心肌的损伤在DCM发生发展过程中占有重要地位,因此认为,DMF针对DCM的抗氧化应激作用可能是DCM防治的潜在新策略。研究目的:本研究拟通过药物诱导建立DCM(1型糖尿病)小鼠模型,经DMF连续治疗,探讨DMF对DCM心肌损伤的治疗作用,分析DMF心肌保护作用的分子机制,试图为DMF可能应用于DCM的临床预防和治疗提供实验数据和理论参考。研究方法:针对8周龄雄性C57BL/6J小鼠经过连续低剂量腹腔注射STZ(50mg/kg)建立1型糖尿病小鼠模型,进而发展为DCM小鼠模型,通过检测血糖水平,评价1型糖尿病小鼠模型的成功与否;设置相同周龄的雄性C57BL/6J小鼠腹腔注射链脲霉素溶剂—柠檬酸钠盐(p H4.5,0.1mol/L)溶液,作为链脲霉素溶剂对照组。将疾病模型组和溶剂对照组各分成2组,共4组,分别进行不同的给药处置:(1)Ctrl组:溶剂对照小鼠腹腔注射生理盐水;(2)Ctrl+DMF组:溶剂对照小鼠腹腔注射DMF溶液;(3)T1D组:1型糖尿病小鼠腹腔注射溶剂;(4)T1D+DMF组:1型糖尿病小鼠腹腔注射DMF溶液。DMF溶于生理盐水给药量为10mg/kg,每日给药,连续12周。在给药的12周内,每月定期记录小鼠体重、血糖;通过无创心脏超声评价小鼠心脏功能和结构;12周治疗结束后,麻醉并处死实验小鼠,解剖取其心肌组织,提取蛋白、m RNA或进行组织切片,观察检测心肌纤维化改变(如天狼星红染色、CTGF、TGF-β1);观察心肌组织的形态改变;利用ELISA和Western blot方法在蛋白水平并利用实时定量PCR在基因转录水平检测心肌组织促炎症因子(TNF-α、PAI-1、IL-1β)、粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)、氧化应激水平(SOD活性、AGES产物、NADPH氧化酶活性、3-NT、4HNE)等多种信号转导通路上各相关因子的水平改变;进一步检测抗氧化应激通路上,Nrf2转录因子及其下游抗氧化蛋白酶(如SOD、NQO-1、HO-1、catalase)等具有清除多余氧化产物的蛋白的转录和翻译水平。通过数据比较和分析,得出结论。研究结果:(1)富马酸二甲酯治疗不影响糖尿病小鼠或对照组小鼠的血糖水平和体重。首先,在12周治疗的时间里,T1D小鼠和Ctrl小鼠相比,T1D小鼠空腹血糖始终明显高于Ctrl小鼠。在经DMF或溶剂治疗后,T1D小鼠和Ctrl小鼠血糖均未明显改变。其次,在比较小鼠心脏重量时,采用心脏重量与胫骨长度之比(HW/TL)。比较发现,T1D小鼠HW/TL较Ctrl小鼠稍低,但没有显著性差异。而DMF治疗或溶剂治疗并未导致HW/TL改变。(2)富马酸二甲酯治疗通过增加射血分数、抑制心肌重构挽救了DCM心功能的下降。应用超声心动图测量显示,同Ctrl小鼠相比,T1D小鼠心脏左室EF和FS值都显著降低,舒张末期和收缩末期左心室内径(LVID)、左室容积(LV vol.)显著增大。DMF治疗后,T1D小鼠心脏左室EF值、收缩末期左心室容积(LV vol;s),比溶剂治疗的T1D小鼠明显减小。这些改变具有显著性差异。另外,DMF部分降低了T1D小鼠舒张末期和收缩末期左心室内径(LVID)和舒张末期左室容积(LV vol;d),升高了T1D小鼠左室FS,但并没有显著性差异。(3)富马酸二甲酯治疗后,通过降低TGF-β1等纤维化相关因子,抑制了DCM的心肌纤维化改变。天狼星红染色显示T1D小鼠心肌纤维化改变较Ctrl小鼠显著。而DMF治疗明显降低T1D小鼠心肌纤维化程度。通过rt-PCR评估纤维化相关因子的基因转录水平,发现T1D小鼠心肌中TGF-β1、CTGF、和纤连蛋白(fibronectin)、胶原蛋白(collagen I)的m RNA转录较Ctrl小鼠明显增加,而DMF治疗使得T1D小鼠上述m RNA的转录水平显著降低。此外,应用Western blot测得DMF治疗的T1D小鼠TGF-β1、CTGF蛋白表达水平较溶剂治疗的T1D小鼠的有所降低,但无显著性差异。(4)富马酸二甲酯通过降低促炎因子和粘附分子,降低了DCM心肌组织促炎症反应和炎症浸润。应用rt-PCR检测实验小鼠心肌组织内促炎因子TNF-α、白细胞介素(IL-1β)、粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)发现,与Ctrl小鼠相比,T1D小鼠心肌组织TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1的m RNA转录水平显著升高。而DMF治疗的T1D小鼠中,TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1的m RNA转录被明显抑制。另外,通过Western blot检测TNF-α、PAI-1、ICAM-1蛋白水平,DMF治疗的T1D小鼠,上述炎性因子较溶剂治疗的T1D小鼠明显降低。(5)富马酸二甲酯通过减少自由基来源和提高抗氧化应激的酶和蛋白的表达明显抑制了DCM心肌中氧化应激的水平。通过ELISA以及Western blot实验方法发现,与Ctrl小鼠相比,T1D小鼠SOD活性显著下降,GSH水平明显降低,同时氧化产物(3-NT、4HNE)水平明显升高,AGEs产物CML加和物增多。同时,超氧阴离子的重要来源--巨噬细胞相关NADPH氧化酶活性在T1D心脏中也显著升高。DMF治疗,降低了T1D小鼠心肌3-NT、4HNE水平、减少了AGEs生成,抑制了NADPH氧化酶活性;同时促进SOD活性,升高GSH含量,提高了心肌抗氧化应激能力。(6)富马酸二甲酯对DCM的保护作用与激活T1D小鼠心肌细胞Nrf2及其下游的抗氧化基因的表达上调相关。通过Western blot、rt-PCR的实验方法发现,与Ctrl小鼠相比,在T1D小鼠心肌细胞内Nrf2蛋白总量明显增加;而与T1D小鼠相比,T1D+DMF小鼠Nrf2蛋白总量升高更显著。因Nrf2入核发挥转录作用,于是提取心肌细胞核蛋白并检测Nrf2含量,结果显示,相对于其他各组,只有经DMF治疗的T1D小鼠心肌细胞核内的Nrf2明显升高。进一步检测Nrf2下游抗氧化应激酶、蛋白的基因的转录和表达,发现在T1D+DMF治疗组,小鼠心肌细胞ho-1、sod1、catalase基因的m RNA转录水平较T1D组都明显升高。相似的,T1D+DMF小鼠HO-1、SOD2和catalase酶蛋白表达也明显升高。而T1D小鼠抗氧化应激的各种酶都有不同程度的降低。DMF治疗并未影响Ctrl小鼠Nrf2及其下游基因的表达水平。结论:(1)富马酸二甲酯可以改善糖尿病所致的心脏结构损伤和功能异常。(2)富马酸二甲酯对糖尿病心肌病心肌组织的保护作用与Nrf2激活并上调其下游抗氧化通路酶和蛋白的表达水平具有高度的相关性。(3)富马酸二甲酯在DCM预防或治疗中具有重要的应用潜力。创新性:(1)本研究首次发现了DMF对糖尿病心肌病的保护作用。(2)首次阐明DMF对DCM的保护作用主要是通过Nrf2的表达上调及其下游抗氧化基因的表达上调,抗击心肌组织氧化应激而实现的。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R587.2;R542.2
【部分图文】：

心肌肥大,糖尿病,纤维化

脏收缩功能和舒张功能改变的影响，糖尿病和心肌肥大具有独立相关性[49, 50]。与心肌肥大的非糖尿病患者相比，糖尿病患者肥大的心肌组织左室舒张功能下降更严重[49]。许多动物实验研究明确了 DCM 心肌肥大的证据，如心脏重量和体重的比值（HW/BW）（前提是每组个体体重平均值在各组之间没有差异性）、心脏重量与胫骨长度比值（HW/TL）、心肌细胞体积、致肥大基因表达等[51]。此外，T2DM 所致心肌肥大在超声影像中表现为心室壁回声密度增强。提示心肌肥大可能是由胶质蛋白沉积的改变而非心肌肥大性改变所致[52, 53]。因此，对于 DCM 心肌肥大性改变的病理、分子机制仍需更透彻的认识和进一步研究。

基质蛋白,种胶,细胞间质,病理性

在糖尿病患者中，经过统一调整患者年龄，糖尿病患病时间、肾功能、压以及自主功能参数后，血浆中的 AGEs 水平与左室等容舒张期时长以及心僵硬程度成正比。另外 Kranstuber 和 Bidasee 等[76, 77]实验表明，心肌细胞AGEs 可以交联 SERCA2a 导致肌浆网钙离子回收通道受损，导致心肌收缩功障碍，而长期应用 AGEs 交联拮抗剂（AGEs crosslink breaker）治疗，可以使分肌浆网钙回收功能接近正常。又有研究发现，通过阻断 AGEs 受体 RAGE左室心肌收缩力得到改善[59, 78, 79]。这提示 RAGE 参与心肌收缩相关机制，同强调 AGEs-RAGE轴调节对于 DCM 病理生理调节的重要性。因此，以 AGEs其相关通路为靶向的治疗策略或许能够改善 DCM 心功能。

心肌组织,心肌重构,心室功能障碍,炎性因子

低 IL-1β、TNF-α 炎性因子水平），缓解心肌纤维化和心衰等表现。同时发现，在小鼠糖尿病模型中通过抑制 p38 mitogen-activated protein kinase蛋白激酶，降低了心肌组织中的促炎症因子，从而改善了心室功能障碍。近期研究发现，激活的重要促炎症转录因子 NF-κB 在多种细胞中（包括 T1DM、T2DM 小鼠模型，人心肌细胞、高汤处理的冠脉内皮细胞等）加重了 ROS/RNS的生成。这两项研究均表明，在糖尿病小鼠模型的心肌组织中，抗炎作用药物同时能够降低氧化应激、减少心肌细胞的死亡、抑制心肌重构和改善的糖尿病个体心脏的收缩功能障碍，如图 2.3 所示。尽管目前许多证据证明，炎症反应是 DCM 潜在的重要靶点，然而能否通过药物调控炎性细胞因子或相关通路达到临床治疗的目的，尚需深入研究。

【参考文献】