基质硬度通过Piezo1调控hUC-MSCs成心肌分化的研究

发布时间：2020-09-26 19:58

　　心肌梗死(myocardial infarction,MI)是全球范围内心源性猝死的最主要原因。由于成体的心肌细胞(cardiomyocytes,CMs)属于终末分化的永久细胞,几乎没有再生能力,故心肌细胞一旦受损将不可避免地发生纤维性修复,丧失了原有心肌的收缩功能。干细胞由于自身具有强大的自我更新和分化潜能,为心肌损伤的细胞治疗带来了新的希望,尤其是人脐带间充质干细胞(Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs),以其提取无创,分离简便,无伦理学争议等优点,已成为该领域基础和应用研究的热点。机体内不同器官和组织,由于所处位置及功能的不同而具有不同的硬度。研究发现通过人工制备不同硬度的生物材料或支架用于细胞的体内外研究,不仅可以体外模拟细胞外基质为细胞提供支撑,而且还可以通过调节生物支架的微结构来影响细胞的行为,进而用于指导干细胞定向分化。Piezo是一种能感受细胞膜机械力变化并迅速做出反应的机械敏感性非选择性阳离子通道,具有压力激活的特性,研究发现基质硬度等机械力刺激能够激活Piezo1,从而调控干细胞分化。已知成熟的正常心肌组织硬度约10-20kPa,心肌梗死发生后由于细胞外基质的过度积累可致其组织硬度增加到35-70kPa。本论文利用模拟健康或疾病状态下心脏组织硬度的生物材料,观察其对调控hUC-MSCs向心肌细胞方向分化的作用及Piezo1在此过程中发挥的作用,为寻找损伤心肌细胞的替代细胞提出新思路。通过组织块培养法获得状态良好的原代hUC-MSCs,对其表面标志物进行鉴定,发现该细胞高表达CD44、CD90和CD105,不表达造血细胞标记CD34、CD45,表明该细胞具有MSCs的表型特征。本实验根据前期工作制备了硬度分别为13-16kPa(软)和62-68kPa(硬)的聚丙烯酰胺水凝胶(Polyacrylamide,PAAM),将P5或P6代次的hUC-MSCs接种在这两种不同硬度基质上培养(day1、day7和day14),观察细胞的行为学变化以及成心肌分化的能力。在不同基质硬度上,hUC-MSCs的细胞形态发生了明显变化:细胞在软基质上形态多呈现为短柱形,类似于肌细胞;而在硬基质上形态多呈现多角形,类似于成骨细胞。通过qPCR检测在这两种不同的基质硬度上早期心肌标志物Nkx2.5、GATA4、Mesp1以及成熟标志物cTnT、cTnI、α-actin的表达,结果显示,在13-16kPa的基质硬度上,hUC-MSCs在第7天时均高表达早期以及成熟心肌标志物;通过Western Blot进一步检测其蛋白水平的表达,除cTnT外,在13-16 kPa的基质硬度上心肌标志物同样在第7天时高表达,表明13-16kPa的基质硬度上hUC-MSCs倾向于心肌方向分化。而在62-68kPa的基质硬度上,qPCR和Western Blot检测结果显示仅Nkx2.5和α-actin均在第七天时表达高过于对照组,且低于13-16kPa,表明62-68kPa的基质硬度对于hUC-MSCs向心肌方向分化的趋势并不明显。在基质硬度诱导人hUC-MSCs成心肌向分化的过程中,Piezo的表达发生变化。发现在第1天时Piezo1随硬度增加表达量增加,而Piezo2虽然也有一定的变化,但是不具有规律性,因此,选择Piezo1作为之后的研究对象。在同一时间点,在第1和7天,Piezo1随基质硬度增加而升高,在14天软基质明显高于其余两组;同一硬度上,Piezo1仅在第1天高表达,在13-16kPa基质硬度上Piezo1在随时间表达趋于稳定,在62-68kPa基质硬度上Piezo1随时间表达逐渐降低。这说明在软基质上Piezo1仅在第1天对于基质硬度敏感,在硬基质上Piezo1的敏感度持续时间更长。同时,检测发现整合素β1和Ca~(2+)的表达也有明显的变化,整合素β1和Ca~(2+)在软基质上表达低于硬基质上。综上所述,hUC-MSCs在硬度为13-16kPa的基质上倾向于心肌分化,而在62-68 kPa的基质上细胞向心肌方向分化的趋势并不明显。在此诱导分化过程中,Piezo1感知基质硬度的力学刺激,可能通过与整合素β1相互影响以及调节Ca~(2+)浓度来发挥作用。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R542.22
【部分图文】：

细胞,脐带,形态,经产妇

第 3 章实验结果第 3 章实验结果3.1 hUC-MSCs的培养与鉴定3.1.1 hUC-MSCs的原代培养从吉林大学第一附属医院获得正常足月胎儿脐带（经产妇本人同意），医院伦理委员会获准。通过组织块培养法从脐带华通胶组织中分离得到大量状态良好的原代细胞。镜下观察发现这些细胞大约在 5-10 天从组织块爬出，刚开始细胞数量少，且形态不均一。随着时间的推移，细胞逐渐增多，多呈现长梭形。随着传代的进行，发现获得的细胞已经逐渐纯化，得到的细胞的形态更加均一，当细胞融合至 80%以上，细胞呈旋涡状或鱼群状。细胞传至 P10 代之后，其生长缓慢，观察其形态有分化的趋势。因此，本实验所用细胞的代次为 5-7 代。A B

流式细胞术,间充质干细胞,造血细胞标记,细胞

第 3 章实验结果为验证获得的细胞是否符合国际细胞治疗协会（ISCT）制定的 MSCs 鉴定最低标准，对获得的细胞进行流式以及免疫荧光检测，发现该细胞高表达粘附性分子CD44，CD90和间充质干细胞标志物CD105，不表达表达造血细胞标记CD34，CD45，表明该细胞具有间充质干细胞的表型特性。

聚丙烯酰胺水凝胶,硬度,心肌纤维化,心肌组织

图 3.3 hUC-MSCs向成脂成骨诱导分化（A） hUC-MSCs向成脂细胞分化油红O染色。Scale bar=50μm（B） hUC-MSCs向成骨细胞分化茜素红染色。Scale bar=50μm3.2 基质硬度的制备制备类心肌组织与类心肌纤维化组织硬度的聚丙烯酰胺水凝胶根据前期工作按照表 3.1 制备出 13-16kPa 和 62-68kPa 两种不同硬度的聚丙烯酰胺水凝胶。本文是根据以往的文献综述进行总结才选择实验硬度为 13-16kPa（类似心肌组织）、62-68kPa（类似心肌纤维化组织）两种基质凝胶作为实验的基材。表 3.1 不同浓度的聚丙烯酰胺水凝胶的成分及比例硬度丙烯酰胺双丙烯酰胺催化剂13-16kPa 8% 0.1% AP、TEMED

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