B型利钠肽不同形式的受体互作、基因调控和临床应用研究

发布时间：2020-09-29 15:13

　　 目的:心衰(HF)患者B型利钠肽(BNP)水平升高,但生物功能和抗HF作用减弱,这即BNP悖论,机制不明。可能的解释是HF患者BNP全长形式减少,截短形式增多,而后者与利钠肽A型受体(NPR-A)的相互作用和产生的生物功能减弱。本研究从受体互作角度,探讨BNP不同形式与NPR-A的相互作用和对过表达NPR-A细胞的生物作用。从基因调控层面,通过分析基因突变[单核苷酸多态性(SNP)]和表观遗传学[脱氧核糖核酸(DNA)甲基化和外泌体微小核糖核酸(miRNA)]探索影响BNP前体(NPPB)基因转录与HF和房颤(AF)发生发展的机制。从临床应用方面,分析氮端B型利钠肽前体(NT-proBNP)判断HF和AF老年患者预后的能力。这些均有助于阐明BNP悖论的机制、解释HF和AF的病程和探索创新性治疗靶点。方法:酶联免疫吸附和表面等离子共振技术检测BNP与NPR-A蛋白的相互作用。CCK-8、Transwell和流式技术分别检测细胞增殖、迁移和凋亡。重测序和MassArray技术检测NPPB基因的SNP位点和甲基化程度。高通量测序检测AF外泌体miRNA。纳入306例HF和219例AF老年患者,COX回归和ROC曲线分析NT-proBNP的预后判断能力。结果:1.BNP1-29等C端截短肽及置换肽与NPR-A蛋白和过表达NPR-A的HEK293T细胞的相互作用较BNP1-32全长肽及BNP3-32等N端截短肽明显减弱(均P0.05)。BNP1-29等C端截短肽及置换肽促进过表达NPR-A的HEK293T细胞增殖、迁移和抑制HEK293T细胞凋亡的生物作用较BNP1-32全长肽及BNP3-32等N端截短肽明显减弱(均P0.05);2.NPPB基因3个外显子和2个内含子区未发现SNP位点,即BNP截短形式的产生与基因突变无关。非编码区发现三个SNP位点,即启动子区的rs198389、5'非编码区的rs3753581和3'非编码区的rs198388。启动子区的rs198389位点突变与射血分数明显负相关,且突变组荧光素酶活性明显降低(均P0.05);3.NPPB基因在HF组和非HF组之间存在甲基化程度明显差异位点(P0.05);4.血浆NT-proBNP水平与HF和AF老年患者全因死亡率明显独立相关(均P0.05)。与西雅图HF评分相比,血浆NT-proBNP水平和基于它的模型有类似的C-statistic值(均P0.05)。与CHADS2和CHA2DS2VASc评分相比,血浆NT-proBNP水平和基于它的模型有明显高的C-statistic值(均P0.05);5.持续性AF患者已知miRNA和对应靶基因的数量明显多于非AF人群(均P0.05);结论:BNP1-32的C端,而非N端,缺失明显抑制BNP与NPR-A的相互结合和发挥生物功能,说明胰岛素降解酶可能是影响BNP活性的关键酶。NPPB基因SNP位点rs198389突变后抑制转录,且与收缩功能相关,说明其可能通过减少BNP合成导致心功能恶化。HF患者NPPB基因存在甲基化差异位点,说明其甲基化可能与HF发病相关。NT-proBNP是与HF和AF老年患者不良预后独立相关的生物标志物,基于它的模型也能很好地判断预后。AF外泌体miRNA生物信息图谱得以建立。
【学位单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R541.6
【部分图文】：

解放军医学院博士学位论文Ｐ１－３２邋全长肽（表邋１）；逡逑Ｐ３－３２、ＢＮＰ４－３２和ＢＮＰ５－３２等Ｎ端三个氨基酸截短肽（表Ｐ１－２９、ＢＮＰ３－２９、ＢＮＰ４－２９和ＢＮＰ５－２９等Ｃ端三个氨基酸）；逡逑氨酸（Ａｌａ）置换ＢＮＰ１－３２的Ｃ端氨基酸并合成了邋ＢＮＰ－ＡＲＨ和Ｃ端氨基酸置换肽（表１）；逡逑ｉ？？＞逡逑

．凝胶电泳验证利钠肽Ａ型受分析（ＥＬＩＳＡ）间接法分ＮＰＲ－Ａ蛋白的结合逡逑被ＮＰＲ－Ａ蛋白，浓度ｌ＾ｇ冲液（ＰＢＳ）洗板３次，２００ｆｉＬ／孔，３７°Ｃ孵育邋３０ｍ３次，加入ＢＮＰｌ－３２全始１：５以含１％ＢＳＡ的ｌｘＬ邋和邋０．８［ｘｇ／ｍＬ，２００（ｘＬ／孔邋洗板邋６邋次，加入小鼠邋ＩｇＧ邋Ｐ１－３２全长肽、截短肽和ｒｇ－Ｌｙｓ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ｉｌｅ－Ｓ

Ａ型受体基因病毒感染后的人胚肾２９３Ｔ细胞（过表达）、空肾２９３Ｔ细胞（阴性对照）和无病毒感染的人胚肾２９３Ｔ细胞（２加入合适浓度的抗生素，筛选４８ｈ。荧光显微镜下观况（图５），荧光效率需要达到１００％后，降低抗生ｌ．ＯＯ＾ｇ／ｍＬ，继续对感染后的细胞进行筛选和扩增。胞（图６），通过实时荧光定量聚合酶链反应（ｑＰＣＲ）基因转录的信使核糖核酸水平，证实ＯＥ组ＮＰＲ－Ａ基是ＮＣ组的１５７．６５倍（Ｐ＜０．０５；图７）。通过免疫印表达丰度，证实ＯＥ组ＮＰＲ－Ａ基因的表达丰度明显８）逡逑３．２．１收集细胞（６孔板８０％细胞密度），２０００邋ｒｐｍ，去上清，Ｔｒｉｚｏｌ试剂盒（普飞）抽提总ＲＮＡ，Ｎａｎｏｄ

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本文编号：2829895