长链非编码RNA-ANRIL在缺氧肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用及机制

发布时间：2020-10-02 08:41

　　 肺动脉高压是一种基于不同病因和发病机制的综合征。当肺动脉高压发生时,肺脉管系统的循环阻力逐渐增加,可能导致右心衰竭和死亡。肺动脉高压的病理特征包括肺血管平滑肌细胞的异常增殖和肺血管重构。缺氧是造成肺动脉高压的主要诱因。它会直接诱导肺动脉平滑肌细胞的收缩和增殖,最终结果导致肺血管重构。近年来的研究表明,长链非编码RNA在许多生物过程中起到关键性作用,其中包括细胞的增殖与凋亡以及心血管疾病的发生和发展。研究显示,长链非编码RNAANRIL能够促进血管平滑肌细胞增殖和动脉粥样斑块的形成。由此推测,ANRIL可能在肺动脉平滑肌细胞中表达,并发挥调控作用。本实验通过实时荧光定量PCR分析在常氧和缺氧条件下,人肺动脉平滑肌细胞中ANRIL的表达变化情况。设计小干扰RNA敲低ANRIL的表达水平,通过MTT法检测细胞活力。在敲低ANRIL的情况下,通过CCK-8检测法分析细胞的增殖情况,用Western blot检测增殖细胞核抗原PCNA蛋白在常氧和缺氧的细胞中表达的变化,细胞免疫荧光观察增殖相关蛋白KI-67的表达变化,进一步确定ANRIL对人肺动脉平滑肌细胞增殖的作用。通过流式细胞术分析ANRIL对人肺动脉平滑肌细胞周期的影响,探索ANRIL对人肺动脉平滑肌细胞周期的调控作用,并通过Western blot测定周期蛋白A、D、E的表达情况。分别在常氧和缺氧的情况下敲低ANRIL,通过细胞划痕实验观察人肺动脉平滑肌细胞迁移距离的变化,采用transwell实验检测人肺动脉平滑肌细胞迁移数量的变化,以探究ANRIL的沉默对缺氧诱导的人肺动脉平滑肌细胞迁移的作用。通过以上实验我们发现,ANRIL在人肺动脉平滑肌细胞中存在表达。当给予细胞缺氧造模处理后,ANRIL的表达量显著下调(P0.01)。用小干扰RNA将ANRIL的表达敲低后,检测到细胞活力有所增加(P0.01),说明ANRIL的表达量对人肺动脉平滑肌细胞有影响。此外,CCK-8实验显示,敲低ANRIL也促进了细胞的增殖情况(P0.01),我们还检测到PCNA的表达有所增加(P0.01),荧光显微镜观察到增殖相关蛋白KI-67的表达上调。接着我们检测了细胞周期的变化,发现ANRIL的沉默能够促进更多的人肺动脉平滑肌细胞向G2/M+S期转移,增加了 G2/M+S期细胞的百分比(P0.05),进而加速了细胞周期进程。同时,周期蛋白A、D和E的表达也发生了变化,当ANRIL表达下调时,周期蛋白的表达量增加(周期蛋白A,P0.01;周期蛋白D、E,P0.001)。这进一步验证了 ANRIL对细胞周期的影响。同时,低表达的ANRIL使人肺动脉平滑肌细胞的迁移距离和迁移数目均有所增加(迁移距离,P0.05;迁移数目,P0.01)。本研究首次发现在缺氧时,ANRIL对人肺动脉平滑肌细胞周期有影响,并能调控人肺动脉平滑肌细胞的增殖和迁移,暗示ANRIL可能是人肺动脉平滑肌细胞的关键调节因子,并为今后发展基因靶向治疗缺氧性PAH提供了研究基础。
【学位单位】：哈尔滨商业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R544.1
【部分图文】：

共１６邋０，冰上配置，３７邋°Ｃ温育５邋ｍｉｎ。加入５邋ｘ邋ＲＴ邋Ｍａｓｔｅｒ邋Ｍｉｘ邋ＩＩ邋４邋ｐｉ，最终得到２０逡逑０的反应体系。放入仪器中，设置温度３７邋°Ｃ，１５邋ｍｉｎ；邋５０邋°Ｃ，５邋ｍｉｎ；邋９８邋°Ｃ，５邋ｍｉｎ。具体逡逑步骤见图２－１。逡逑－９－逡逑

将细胞分为阴性对照组（ｓｉ－ＮＣ）和干扰片段组（ｓｉ－ＡＮＲＩＬ）。根据实时荧光定量ＰＣＲ逡逑的数据结果分析，转染了干扰片段组（ｓｉ－ＡＮＲＩＬ）的细胞中ＡＮＲＩＬ的表达水平比其在阴性逡逑对照组（ｓｉ－ＮＣ）的表达明显降低（尸＜０．００１邋），如图２－３所示。证明所设计的干扰序列能逡逑够有效的降低ＡＮＲＩＬ在细胞中的表达量。逡逑１．５＊逡逑ｃ逡逑0逡逑Ｗ邋＊１邋0．逦逡逑０逡逑Ｑ．逦＜逡逑ＬＵ逡逑０邋０．５－逦＊＊＊逡逑．＞逦Ｔ逡逑ｒｏ逦．逡逑０逡逑＾邋ｏ．ｏ－Ｕ逦ＬＩ逦逡逑ｓｉ－ＮＣ邋ｓｉ－ＡＮＲＩＬ逡逑－１２－逡逑

逑ｓｉ－ＮＣ：阴性对照组ｓｉ－ＡＮＲＩＬ：干扰片段组逡逑图２－３邋ＳｉＲＮＡ转染后ＡＮＲ１Ｌ的表达变化逡逑＊＊＊尸邋＜000１，ｘ士邋ｓｅｍ。逡逑Ｆｉｇ．邋２－３邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ邋ｏｆ邋ＡＮＲＩＬ邋ａｆｔｅｒ邋ｓｉＲＮＡ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ逡逑＜邋0．00邋１，邋ｘ邋土邋ｓｅｍ．逡逑２．４．３邋ＭＴＴ法翻ｌｊ细胞活力逡逑将细胞分别按分组要求转染后，检测其细胞活力。分析数据发现，缺氧组和阴性对照逡逑组的细胞活力大致相同；而且与常氧组相比，以上两组的细胞活力更高（Ｐ＜０．０１）。将干逡逑扰片段组的细胞活力与印象对照组相对比，前者的细胞活力有明显增加（Ｐ＜邋０．０１），如图逡逑２－４所示。说明缺氧时ＡＮＲＩＬ表达量的变化对ＨＰＡＳＭＣｓ的活力确实有影响。逡逑１．０＊ｉ逦＊＊逡逑５Ｓ逦＊＊逦逡逑＊＊？逡逑？翁逦Ｔ邋Ｔ逡逑ｇ邋０．５－逡逑Ｏ邋．逡逑ｏ．ｏ－Ｕ—ＬＩ逦Ｕ—Ｕ—Ｌ逡逑ＣＯＮ邋ＨＹＰ邋ｈｙｐ＋ｓｉ－ＮＣ邋ｈｙｐ＋ｓｉ－ＡＮＲＩＬ逡逑ＣＯＮ：常氧组ＨＹＰ：缺氧组逡逑ｈｙｐ邋＋邋ｓｉ－ＮＣ：缺氧＋阴性对照组ｈｙｐ邋＋邋ｓｉ－ＡＮＲＩＬ：缺氧＋干扰片段组逡逑图２－４邋ＡＮＲＩＬ对细胞活力的作用逡逑＊＊Ｐ＜０．０１，邋ｘ土邋ｓｅｍ0逡逑Ｆｉｇ．邋２－４邋Ｔｈｅ邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＡＮＲＩＬ邋ｏｎ邋Ｃｅｌｌ邋Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ逡逑＊＊Ｐ＜０．０１，ｘ邋士邋ｓｅｍ．逡逑２．５本章小结逡逑本实验将ＨＰＡＳＭＣｓ分别进行常氧和缺氧培养造模。设计了邋ＡＮＲＩＬ的ＰＣＲ引物。造模逡逑完成后提取细胞总ＲＮＡ并逆转录。通过实时荧光定量ＰＣＲ法

【参考文献】

相关期刊论文 前4条

1 张晓丹;杨艳南;王淑静;朱大岭;王力维;盛洁静;宋莎莎;;葛根素对PI3K/AKT通路介导PASMCS凋亡的影响[J];中国中药杂志;2015年15期

2 张晓丹;王力维;王淑静;朱大岭;杨艳南;盛洁静;宋莎莎;;葛根素通过调控活性氧对缺氧诱导的PASMCs增殖的影响[J];中国中药杂志;2015年15期

3 张晓丹;孙鹏;朱大岭;谢楠;;牛磺酸抑制缺氧诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及信号转导机制[J];中国中药杂志;2014年10期

4 郭耀磊;吴炳祥;;内皮素1受体拮抗剂在先天性心脏病相关肺动脉高压治疗中的应用研究进展[J];医学综述;2013年09期

本文编号：2832183