冠心病患者血浆microRNA表达谱的筛选及其临床意义研究

发布时间：2020-10-11 04:40

　　 研究背景冠心病(CAD)是一种严重威胁人类健康的疾病之一,且发病率呈逐年上升趋势,而早期诊断和治疗冠心病能有效降低其死亡率;但目前尚无理想的诊断冠心病的生物标志物,因此发展一种新的、有更高的敏感性和特异性的生物标志物具有重要意义。Micro RNA(mi RNA)是一类长度为19~24个核糖核苷酸的非编码内源性小单链RNA分子,且在心血管系统高度表达,几乎参与调控了心脏所有的病理生理过程,在心脏的正常发育、冠状动脉粥样硬化、心肌细胞损伤等过程中均发挥着重要作用。近年来研究发现血浆中mi RNA能稳定存在,且随疾病发生发展而表达水平发生改变;因此,血浆mi RNA检测可能成为冠心病诊断和治疗的理想生物标志物;而目前这方面的研究尚很少。目的:本研究的目的是筛选出冠心病患者血浆中与正常人血浆相比存在显著差异的mi RNAs;同时进一步研究上游转录因子对mi RNA(s)的调控作用,为mi RNA(s)在冠心病发病机制中的调控作用提供实验基础。方法:选择2012年9月至2013年10月在宁波市医疗中心李惠利医院心血管内科就诊患者,冠心病组为通过冠状动脉造影诊断至少有一条或一条以上的主干冠状动脉狭窄大于50%或以上的患者;正常对照组为通过冠状动脉造影诊断冠状动脉未见狭窄或仅有心肌桥病变的患者。运用mi RNA基因芯片技术初步筛选冠心病病人和正常健康者血浆中的mi RNA表达谱,每组各3例样本,然后通过对基因芯片结果进行聚类分析,并对冠心病组中表达显著升高且差异倍数5倍的mi RNAs进一步采用q RT-PCR技术进行扩大样本量(冠心病组:120例,正常对照组120例)验证,以寻找在冠心病中有显著差异表达的mi RNAs。同时,通过生物信息学软件预测与冠心病相关mi RNA(s)基因启动子区转录因子结合位点;然后进一步应用双萤光素酶实验进行验证其可靠性。结果:mi RNA基因芯片初筛结果显示,与正常组相比,有4个mi RNAs(mi R-206、mi R-302a-3p、mi R-383、mi R-574-5p)在冠心病组中表达显著升高(P值均0.01)且表达倍数均大于5倍。进一步运用q RT-PCR技术扩大样本量进行验证结果显示,mi R-206和mi R-574-5p在冠心病组中的表达水平与正常组相比仍存在显著差异(P值均0.01);且ROC曲线表明这两个mi RNAs对冠心病的诊断均有较好的敏感性和特异性。同时,生物信息学软件预测hsa-mi R-206启动子区有2个转录因子Myo D结合位点;进一步双萤光素酶报告基因测定系统证实Myo D能与hsa-mi R-206启动子区直接进行靶向结合作用。结论:血浆mi R-206和mi R-574-5p在冠心病病人中表达显著升高,可能成为诊断冠心病的循环生物标志物;同时转录因子Myo D能与hsa-mi R-206上游启动子区直接结合,这为进一步研究转录因子Myo D与mi R-206的相互作用及mi R-206与冠心病相关的生物网络调控研究奠定实验基础。
【学位单位】：宁波大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R541.4
【部分图文】：

GenePix Pro 6.0软件完成分析, 通过原始值减去背景值来做修正, 并用中值做标准化, 分别计算出3个冠心病患者及3个正常对照样本中miRNA的标准值及两两之间标准值的比值. 用Volcano Plot 挑选出差异表达的miRNA(图1), 用MEV软件对差异表达miRNA进行聚类分析。结果显示：通过miRNA基因芯片检测并统计分析后结果显示，表达差异倍数大于5倍的miRNA分子共33个(图2)。本实验进一步根据以下两个标准： 冠心病组与正常对照组相比，miRNA表达升高有显著差异（P<0.01）； 通过生物信息学预测相关miRNA的靶基因证实与冠心病的发生有关[15-17]，初步筛选出4个差 异 表 达 的 miRNAs（ miR-206、 miR-302a-3p、 miR-383、 miR-574-5p） （ 表2）。图 1 火山口图：冠心病患者与正常对照组之间 miRNA 表达差异Figure 1. Volcano plot of all pairwise comparisons. Comparisons of all miRNAsassessed in microarray analysis of RNA isolated from plasma of patients withCAD(n=3) or healthy volunteers(n=3). The volcano plot displays the relationshipbetween fold-change and significance between the two groups using a scatter plotview. The y-axis is the negative log10 of P values(a higher value indicates g

件对差异表达miRNA进行聚类分析。结果显示：通过miRNA基因芯片检测并统计分析后结果显示，表达差异倍数大于5倍的miRNA分子共33个(图2)。本实验进一步根据以下两个标准： 冠心病组与正常对照组相比，miRNA表达升高有显著差异（P<0.01）； 通过生物信息学预测相关miRNA的靶基因证实与冠心病的发生有关[15-17]，初步筛选出4个差 异 表 达 的 miRNAs（ miR-206、 miR-302a-3p、 miR-383、 miR-574-5p） （ 表2）。图 1 火山口图：冠心病患者与正常对照组之间 miRNA 表达差异Figure 1. Volcano plot of all pairwise comparisons. Comparisons of all miRNAsassessed in microarray analysis of RNA isolated from plasma of patients withCAD(n=3) or healthy volunteers(n=3). The volcano plot displays the relationshipbetween fold-change and significance between the two groups using a scatter plotview. The y-axis is the negative log10 of P values(a higher value indicates greater

10.6 冠心病组与正常对照组中 miRNA 的相对表达水平选择年龄、性别均匹配的冠心病患者（120 例）和正常对照组（120 例），提取血浆中的 RNA, 运用 miR-206、miR-302a-3p、miR-383、miR-574-5p 分子末端加 poly(A)尾法进行逆转录，再用 SYBRGreen 法进行 real-time PCR 检测，RNU6 (核仁小 RNA)做为内参。计算 2- CT后，通过两组比较 t 检验分析病例和对照组中的 miR-206、miR-302a-3p、miR-383、miR-574-5p 的表达差异。结果显示，病例组中 miR-206 和 miR-574-5p 的表达水平显著高于正常对照组, 差异有统计学意义（P 值均<0.01)；而病例组中 miR-302a-3p 和 miR-383 的表达水平与对照组相比，差异无统计学意义（p 值分别=0.359；p=0.918）。见图 5A-D。
【共引文献】

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本文编号：2836082