CCDC80下调血管平滑肌细胞LPL表达对动脉粥样硬化的影响及机制

发布时间：2020-10-11 10:29

　　动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑梗死和外周血管疾病的主要原因。AS的发病机制十分复杂,主要包括血管内皮细胞损伤、脂质代谢异常、炎症与免疫等。其中脂质代谢异常是AS的病理基础,主要包括高胆固醇血症、高甘油三脂血症、低密度脂蛋白代谢异常和高密度脂蛋白代谢异常等。研究显示高甘油三酯血症是冠心病、高血压、糖尿病等代谢综合征相关疾病发生的重要危险因素。因此,研究调控血浆甘油三酯代谢的机制对于AS防治具有重要意义。脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase,LPL)是一种分泌型糖蛋白,通过水解富含甘油三酯脂蛋白如极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)、乳糜微粒(Chylomicron,CM)核心的甘油三酯(triglyceride,TG),降低血浆TG水平。研究发现,敲除小鼠LPL后,其血浆TG水平显著升高,主动脉根部出现AS斑块;而过表达肌肉组织、心脏和脂肪组织的LPL能够显著降低血浆TG水平,减少AS斑块面积,提示LPL是调控血浆TG代谢的关键酶,能够有效防止AS发生发展。研究显示代谢综合征患者体内LPL甲基化水平增加,并且LPL甲基化水平与血浆TG水平和代谢特征异常呈正相关。因此寻找抑制LPL甲基化修饰的机制,对于调控血浆TG代谢具有重要意义。卷曲螺旋结构域蛋白80(coiled-coil domain-containing protein 80,CCDC80)是一种由脂肪细胞、平滑肌细胞等表达和分泌的蛋白。CCDC80能够促进肺动脉高压的发生、发展,并增加肥胖相关的代谢性疾病发病风险。研究显示,在肥胖患者血浆CCDC80水平显著增加,并与禁食状态下血浆TG水平和动脉粥样硬化程度呈正相关,提示CCDC80可能参与AS发生发展过程。因此,研究CCDC80对LPL介导的TG水解及AS的发生发展的影响及机制具有重要的意义。调控CCDC80表达的作用机制尚未阐明。大量研究证实,非编码RNAs在脂质代谢及AS过程中发挥着举足轻重的作用。微小RNA(micro RNAs,mi RNAs)通过与靶基因的3’非翻译区(3'untranslated region,3’UTR))结合抑制其表达,参与AS发生发展的多个阶段。mi R-141-3p/200a-3p参与脂质代谢过程,但具体机制未明。生物信息学预测显示mi R-141-3p/200a-3p能够与CCDC80的3’UTR结合,提示mi R-141-3p/200a-3p可能通过调控CCDC80表达参与LPL表达调控。长链非编码RNAs(long non-coding RNAs,lnc RNAs)可通过与mi RNAs相互作用调控脂质代谢过程参与AS进程。长链非编码RNA转移相关肺腺癌转录因子-1(lnc RNA metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript-1,lnc RNA MALAT1)通过调控CDC36表达影响泡沫细胞形成,表明lnc RNA MALAT1参与脂质代谢过程,但其对CCDC80与LPL的调控作用尚未阐明。生物信息学预测发现lnc RNA MALAT1能够与mi R-141-3p/200a-3p序列结合,提示MALAT1可能通过mi R-141-3p/200a-3p参与CCDC80及LPL表达调控。据此,我们将研究分为如下四个部分:(1)培养VSMCs,过表达或沉默CCDC80,检测LPL表达水平,明确CCDC80对LPL的调控作用;(2)过表达或沉默CCDC80、TET2,检测ERK1/2磷酸化水平、TET2表达、LPL启动子DNA甲基化水平、LPL表达,阐明CCDC80通过ERK1/2-TET2途径促进LPL启动子DNA甲基化,抑制LPL表达的分子机制;(3)以Apo E-/-小鼠为实验对象,转染CCDC80或sh CCDC80,观察其对Apo E-/-小鼠主动脉LPL表达,血浆脂质水平、主动脉脂质蓄积情况和As斑块面积的影响,整体水平明确CCDC80促As的作用机制;(4)mi R-141-3p/200a-3p mimic/inhibitor或MALAT1/si MALAT1转染VSMCs,检测CCDCC80和LPL表达情况明确MALAT1-mi R-141-3p/200a-3p对CCDC80与LPL的调控作用。第一部分CCDC80抑制人主动脉血管平滑肌细胞LPL表达目的:研究CCDC80对血管平滑肌细胞LPL表达的影响。方法:使用DMEM高糖培养基培养人主动脉血管平滑肌细胞(human artery vascular smooth muscle cells,HA-VSMCs),构建CCDC80过表达和沉默载体并分别转染细胞,通过Western Blot检测CCDC80过表达与沉默效果;q PCR和Western Blot方法分别检测LPL m RNA和蛋白表达水平。结果:细胞稳定转染CCDC80或CCDC80 sh RNA。q PCR和Western Blot方法检测发现,CCDC80过表达显著下调HA-VSMCs中LPL m RNA和蛋白表达;CCDC80 sh RNA处理显著上调HA-VSMCs中LPL m RNA和蛋白表达。小结:CCDC80过表达下调LPL m RNA和蛋白表达,而沉默CCDC80则上调LPL m RNA和蛋白表达。第二部分CCDC80抑制LPL表达的分子机制目的:研究CCDC80影响LPL表达的作用机制。方法:使用DMEM高糖培养基培养HA-VSMCs,使用CCDC80或CCDC80 sh RNA转染细胞,Western Blot检测转染效果;Western Blot方法检测细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase 1/2,ERK1/2)水平以及磷酸化ERK1/2水平;VSMCs细胞使用10μM的ERK1/2激动剂Curcumin或抑制剂PD98059处理,q PCR和Western Blot方法分别检测LPL m RNA和蛋白表达水平;明确CCDC80通过ERK1/2调控LPL表达。过表达或沉默CCDC80,采用甲基化特异性PCR方法检测LPL启动子DNA甲基化水平;相应方法检测细胞5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-m C)和5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine,5-hm C)水平;q PCR和Western Blot方法分别检测TET甲基胞嘧啶双加氧酶2(ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 2,TET2)m RNA和蛋白表达水平;过表达或沉默TET2,Western Blot方法检测TET2转染效果;采用甲基化特异性PCR方法检测LPL启动子DNA甲基化水平;相应方法检测细胞5-m C和5-hm C水平;q PCR和Western Blot方法分别检测LPL m RNA和蛋白表达水平,明确CCDC80通过TET2影响LPL启动子DNA甲基化修饰进而调控其表达。过表达或沉默CCDC80,同时HA-VSMCs使用10μM的ERK1/2激动剂Curcumin或抑制剂PD98059处理,Western Blot检测TET2和LPL的表达情况;HA-VSMCs转染CCDC80 sh RNA,免疫共沉淀方法检测TET2与FOXO3a的结合情况。使用FOXO3a si RNA转染HA-VSMCs,Western Blot检测沉默效果,q PCR和Western Blot检测LPL m RNA和蛋白表达情况。结果:CCDC80或CCDC80 sh RNA在细胞稳定表达。q PCR和Western Blot方法检测发现,CCDC80过表达显著下调HA-VSMCs中LPL、TET2 m RNA和蛋白表达;降低ERK1/2磷酸化水平,但并不影响总的ERK1/2水平;增加5-m C水平,降低5-hm C水平。甲基化特异性PCR结果显示CCDC80过表达显著增加LPL启动子DNA甲基化水平。CCDC80 sh RNA处理显著上调LPL和TET2表达;增加p-ERK1/2和5hm C水平;降低LPL启动子DNA甲基化和5m C水平。CCDC80 sh RNA与ERK1/2抑制剂PD98059共同处理能够下调LPL和TET2表达,增加LPL启动子DNA甲基化水平和5-m C水平,降低5-hm C水平;而CCDC80与ERK1/2激动剂Curcumin共同处理则上调LPL和TET2表达,降低LPL启动子DNA甲基化水平和5-m C水平,增加5-hm C水平,免疫共沉淀结果显示CCDC80 sh RNA显著减少TET2与FOXO3a的相互作用。FOXO3a si RNA能够部分阻断CCDC80 sh RNA对LPL表达的上调作用。小结:(1)CCDC80通过增加LPL启动子DNA甲基化水平,从而抑制LPL表达。(2)CCDC80通过降低ERK1/2磷酸化水平,下调TET2表达,促进LPL启动子DNA甲基化修饰,抑制LPL表达。(3)CCDC80通过抑制FOXO3a与TET2的相互作用参与对LPL表达的调控。第三部分CCDC80加速apoE~(-/-)小鼠动脉粥样硬化斑块形成目的:以apo E基因敲除(apolipoprotein E deficiency,apoE~(-/-))小鼠为研究对象,探讨CCDC80对apoE~(-/-)小鼠LPL表达与活性、血浆脂质水平及AS斑块形成的影响。方法:将8周龄的雄性apoE~(-/-)小鼠随机分为对照组(Control组)、CCDC80过表达组(CCDC80组)和CCDC80沉默组(sh CCDC80组),每组10只,分别转染重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,r AA)、r AA-CCDC80和r AA-sh CCDC80。Apo E-/-小鼠采用高脂/高胆固醇饮食喂养12周后进行安乐死。分离各组apoE~(-/-)小鼠主动脉,Western Blot检测主动脉CCDC80蛋白表达情况,明确转染效果。喂养期间每两周对小鼠进行称重并记录。在处死前,给禁食12小时的apoE~(-/-)小鼠注射300 U/kg肝素,十分钟后通过摘眼球取血。血液收集到具有EDTA的管中进行离心获得血浆,采用化学发光法检测血液样本中谷丙转氨酶(cerealthirdtransaminase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)水平;采用商业酶试剂盒检测血浆中总胆固醇(total cholesterol,TC)、非高密度脂蛋白胆固醇(non-high density lipoprotein cholesterol,non-HDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)以及TG水平,LPL活性检测试剂盒检测肝素处理后血浆中LPL活性。分离各组apoE~(-/-)小鼠主动脉,q PCR和Western Blot检测LPL表达情况。主动脉窦冰冻切片,免疫荧光染色检测LPL表达、LPL与血管平滑肌细胞标志物α平滑肌肌动蛋白(α-Smooth muscle actin,α-SMA)定位情况。分离各组小鼠主动脉弓,通过体视显微镜观察主动脉弓处AS斑块面积。纵向剖开主动脉(从主动脉弓到髂总动脉分支处),油红O染色观察脂质蓄积情况。分别用HE、Masson和油红O染色检测主动脉窦AS斑块面积、胶原含量以及脂质蓄积情况。结果:采用Western Blot检测主动脉CCDC80表达情况,结果显示高脂高胆固醇饮食喂养的apoE~(-/-)稳定转染CCDC80。过表达或沉默CCDC80不影响小鼠的体重。CCDC80过表达或沉默对血浆中ALT、AST和ALP的含量无影响,说明CCDC80过表达或沉默不影响小鼠的肝功能。CCDC80过表达显著增加血浆TC、non-HDL-C和TG水平,对HDL-C水平无影响。CCDC80过表达显著降低血浆LPL活性,减少主动脉LPL表达,免疫荧光结果显示CCDC80过表达显著降低主动脉瓣膜斑块处LPL的荧光强度,同时发现主动脉瓣膜斑块处LPL与α-SMA存在共定位现象;CCDC80过表达增加apoE~(-/-)小鼠主动脉弓处的斑块面积,促进主动脉内脂质蓄积,增加主动脉窦内AS斑块面积和脂质蓄积,加速AS的发生。而sh CCDC80增加LPL表达和活性,降低血浆TC、non-HDL-C和TG水平,减少主动脉脂质蓄积,抑制AS斑块形成,延缓apoE~(-/-)小鼠AS发生发展。小结:(1)CCDC80通过抑制LPL m RNA和蛋白表达,降低血浆LPL活性,升高血浆脂质水平从而加速apoE~(-/-)小鼠AS斑块形成。第四部分MALAT1-mi R-141-3p/200a-3p对CCDC80的表达调控目的:研究MALAT1-mi R-141-3p/200a-3p对CCDC80表达的调控作用。方法:通过生物信息学网站分析与CCDC80的3’UTR相互作用的mi RNAs,并分析两者结合自由能情况。然后通过培养HEK 293T细胞,使用荧光素酶报告基因的方法检测mi R-141-3p/200a-3p与CCDC80的结合情况。用40μM mi R-141-3p/200a-3p mimics或inhibitors转染HA-VSMCs 24小时,随后通过q PCR检测转染效率;q PCR和Western Blot方法分别检测CCDC80和LPL m RNA与蛋白表达情况。通过生物信息学网站发现lnc RNA MALAT1与mi R-141-3p和mi R-200a-3p存在相互作用。培养HEK 293T细胞,通过荧光素酶报告基因检测两者结合情况。细胞转染MALAT1或MALAT1 si RNA,q PCR检测过表达与沉默效果,并检测过表达或沉默lnc RNA MALAT1对mi R-141-3p和mi R-200a-3p表达的影响。lnc RNA MALAT1与mi R-141-3p mimic或mi R-200a-3p mimic共同转染HA-VSMCs,q PCR和Western Blot方法分别检测CCDC80和LPL m RNA和蛋白表达情况;lnc RNA MALAT1 si RNA与mi R-141-3p/200a-3p inhibitors共同转染HA-VSMCs,q PCR和Western Blot方法分别检测CCDC80和LPL m RNA和蛋白表达情况。结果:生物信息学结果显示CCDC80的3’UTR与mi R-141-3p/200a-3p存在结合情况,CCDC80在不同物种中序列高度保守。此外分析发现mi R-141-3p与mi R-200a-3p序列高度保守,只有一个碱基序列不同。Mi R-141-3p/200a-3p与CCDC80的结合自由能较低。荧光素酶报告基因显示mi R-141-3p/200a-3p与CCDC80的3’UTR存在结合,能够显著降低其荧光素酶活性,但不与突变的CCDC80的3’UTR发生结合。使用mi R-141-3p mimic和mi R-200a-3p mimic转染细胞,mi R-141-3p和mi R-200a-3p表达水平显著增加,并能够显著下调CCDC80 m RNA和蛋白表达,但增加LPL m RNA和蛋白表达水平。而mi R-141-3p inhibitor和mi R-200a-3p inhibitor转染细胞显著降低mi R-141-3p和mi R-200a-3p表达水平,增加CCDC80表达,下调LPL表达。生物信息学分析发现lnc RNA MALAT1与mi R-141-3p和mi R-200a-3p存在结合位点;荧光素酶报告基因证实lnc RNA MALAT1能够与mi R-141-3p和mi R-200a-3p进行结合。VSMCs通过转染lnc RNA MALAT1或MALAT1 si RNA,q PCR检测证实lnc RNA MAMLT过表达和干扰成功;同时结果显示lnc RNA MALAT1过表达减少mi R-141-3p和mi R-200a-3p表达水平,而lnc RNA MALAT1 si RNA增加其表达水平。q PCR和western blot检测结果显示,mi R-141-3p/200a-3p mimics显著抑制lnc RNA MALAT1对CCDC80表达上调和LPL表达下调的作用;mi R-141-3p/200a-3p inhibitors则显著抑制lnc RNA MALAT1 si RNA对CCDC80表达的下调和LPL表达的上调作用。小结:(1)mi R-141-3p和mi R-200a-3p序列高度保守,两种通过与CCDC80的3’UTR序列结合抑制其表达。(2)mi R-141-3p/200a-3p通过抑制CCDC80参与LPL表达调控。(3)lnc RNA MALAT1能够与mi R-141-3p和mi R-200a-3p序列结合并抑制其表达。○4 lnc RNA MALAT1通过降低mi R-141-3p/200a-3p水平,促进CCDC80表达,抑制LPL表达。结论1.CCDC80抑制人主动脉血管平滑肌细胞中LPL m RNA和蛋白表达。2.CCDC80通过抑制ERK1/2的激活,下调TET2表达,从而增加LPL启动子DNA甲基化水平,抑制LPL表达,FOXO3a部分参与CCDC80对LPL的表达调控。3.CCDC80抑制LPL表达和活性,增加血浆脂质水平,加速apoE~(-/-)小鼠AS斑块形成。4.CCDC80表达受到MALAT1-mi R-141-3p/200a-3p的调控。
【学位单位】：南华大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R543.5
【部分图文】：

过表达