研究背景:糖尿病(diabetes mellitus,DM)居高不下的患病率及其多种相关并发症,严重威胁人类的身心健康。糖尿病性心肌损伤(diabetic myocardialinjury,DMI)作为DM的主要心血管并发症之一,指即使不伴有冠状动脉硬化或高血压等其它心血管疾病,心脏在持续高糖的环境下仍可出现一系列心肌结构损伤及功能异常,并最终引发心力衰竭、心律失常、猝死,致残和致死率极高。DMI致病过程中的相关分子机制极为复杂,信号通路众多,尚未被详尽阐明。氧连-N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)修饰是一种蛋白质翻译后修饰,广泛参与调控细胞内多种病理生理过程。同时,自噬作为细胞内一种程序性死亡,由自噬体的形成、膜的延伸以及自噬溶酶体降解等多个环节组成,其整个过程又被称之为自噬流,对维持细胞自身稳态具有重要意义。虽然O-GlcNAc修饰与自噬均分别被证实与DMI的发生有密切关系,但对于两者在DMI中的关联机制知之甚少。新近研究显示,在果蝇、线虫等多种生物模型中,膜突触相关蛋白SNAP 29可与STX17,VAMP8形成复合物影响自噬流的过程,同时SNAP29可作为底物蛋白被O-GlcNAc修饰。我们前期研究发现,链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的DMI大鼠模型中O-GlcNAc糖基化水平升高,并伴有自噬流的抑制。然而,在哺乳动物DM疾病模型中,O-GlcNAc修饰SNAP29是否参与调控自噬流以及其具体分子机制的研究未见报道。研究目的:既往研究提示,蛋白SNAP29既可参与自噬过程,也可被O-GlcNAc修饰,是解析O-GlcNAc修饰与自噬关联机制的纽带。O-GlcNAc修饰、自噬及DMI三者之间的相互关联启发我们研究探索:O-GlcNAc修饰SNAP29是否通过调控自噬流参与DMI的致病过程?为此,我们通过在体动物和离体细胞实验揭示O-GlcNAc糖基化修饰SNAP29通过调控自噬流参与DMI的发生及发展,并探讨其潜在的分子机制以及作用的具体环节,为将来DMI的临床治疗提供了可能的新靶点与机遇。研究方法:在体动物实验将大鼠分为四组:对照组(Vehicle)、糖尿病+生理盐水组(STZ+Nacl)、糖尿病+O-GlcNAc糖基化抑制剂组(STZ+6-Diazo-5-oxo-L-norleucine,STZ+Don)以及糖尿病+O-GlcNAc糖基化激动剂组(STZ+Thiamet G,STZ+TG)。本研究动物实验所采用实验方法包括:血糖和体重测定、超声心动图(Vevo2100)、Western-Blot、免疫共沉淀、组织学苏木-伊红(HemotoxylinEosin,HE)染色、马松(Masson)染色、透射电子显微镜等。细胞实验所采用实验方法包括:原代乳鼠心肌细胞(neonatal rat cardiomyocytes,NRCMs)分离和培养、高糖(Glu:25 mM/L)处理、Western-Blot、免疫共沉淀、腺病毒载体构建和质粒的分离纯化及透射电子显微镜等。离体细胞实验分为:正常糖浓度处理组(normal glucose,Vehicle)、高糖浓度处理组(high glucose,Glu)、正常糖+O-GlcNAc糖基化激动剂组(TG)、高糖+O-GlcNAc糖基化激动剂组(Glu+TG)、正常糖+O-GlcNAc糖基化抑制剂组(Don)和高糖+O-GlcNAc糖基化抑制剂组(Glu+Don),以及基因转染技术干预后的正常糖转染对照组(con+sh-ctrl组)、正常糖转染干扰OGT组(con+sh-OGT)、正常糖转染过表达OGA组(con+ad-OGA)、高糖转染对照组(Glu+sh-ctrl)、高糖转染干扰OGT组(Glu+sh-OGT)、高糖转染过表达OGA组(Glu+ad-OGA)。研究结果:1.经STZ诱导8周的大鼠(8-week STZ大鼠)呈现典型的Ⅰ型DM表现,伴有DMI,心肌O-GlcNAc修饰的增加与自噬流的抑制。结果显示:8-week STZ组大鼠相比正常对照组(Vehicle组),血糖增高、饮食饮水量增加,体重下降,心脏肥厚(心脏重量/体重比值增加);超声结果显示:心脏舒张功能减退(E/A比值明显下降)及左室质量、左室舒张/收缩末容积的明显增加;组织学检测结果显示:心肌排列紊乱、脂肪堆积、纤维增生。8-week STZ大鼠血糖持续升高的同时,利用Western-Blot检测到O-GlcNAc修饰水平及其N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(OGT)表达增加,N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(OGA)的表达降低;同时检测自噬相关标记蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ与P62的表达增加,透射电子显微镜下可观察到明显蓄积的自噬体。2.在体增加O-GlcNAc修饰可加重Ⅰ型DM大鼠心肌损伤并抑制其自噬流。分别给予STZ大鼠O-GlcNAc糖基化修饰激动剂(Thiamet-G,TG)与抑制剂(6-diazo-5-oxo-l-norleucine,Don),结果显示:TG导致STZ大鼠心肌O-GlcNAc修饰增加,心脏舒张功能恶化(E/A下降或E/A大于2),左室舒张/收缩末容积的明显增加,心肌排列紊乱、脂肪堆积、纤维增生加重,且自噬流被进一步抑制;而Don可降低O-GlcNAc修饰水平,同时缓解恶化的心脏舒张功能、减少左室舒张/收缩末容积,以及改善心肌异常结构,并使得自噬流顺利进行。3.离体增加O-GlcNAc修饰可抑制NRCMs自噬流进行。与在体实验一致,离体NRCMs经高糖刺激后,分别给予TG与Don,结果显示:TG增加NRCMs O-GlcNAc修饰的同时,LC3Ⅱ/Ⅰ,Beclin1,P62,LAMP2表达水平均增高,自噬流进一步被阻碍;相反,Don则明显降低O-GlcNAc水平,可促进自噬流进行。利用基因转染技术,同样证实干扰OGT或过表达OGA均可降低O-GlcNAc修饰,促进自噬流进行。4.高糖抑制自噬流的降解阶段。在NRCMs水平,通过干扰LAMP2的表达、给予自噬抑制剂3-MA,分别抑制自噬流的降解及起始阶段;高糖水平下,干扰LAMP2不能进一步增加Beclin1、LC3-Ⅱ/Ⅰ的水平;经自噬起始抑制剂3-MA干预,LC3Ⅱ/Ⅰ与P62的表达水平,不同于单纯高糖诱导的NRCMs,而出现下降;以上均证实高糖并不影响自噬的起始阶段,而是参与抑制自噬的降解阶段。5.SNAP29 O-GlcNAc修饰阻碍SNAP29-STX17-VAMP8复合物形成而抑制自噬流的降解阶段。采用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)检测到SNAP29的O-GlcNAc修饰可通过负向调控SANP29-VAMP8-STX17复合物的形成影响自噬流的降解。激动剂TG增加SNAP29的O-GlcNAc修饰,同时减少SNAP29、VAMP8、STX17三者间相互结合;给予抑制剂Don、沉默OGT或过表达OGA可减少SNAP29 O-GlcNAc修饰,而促进SNAP29-VAMP8-STX17三者复合物形成。结论:1.8-week的STZ大鼠具有典型的早期Ⅰ型DMI表现:心脏舒张功能减退,左室质量、左室舒张/收缩末容积的明显增加及心肌排列紊乱,脂肪堆积,纤维增生;2.8-week的STZ大鼠中心肌O-GlcNAc修饰增加,自噬流受抑制,DMI加重;3.在体动物与离体细胞实验一致证实,增加O-GlcNAc修饰水平,自噬流将进一步被抑制;而减少O-GlcNAc修饰,使自噬流恢复顺畅;4.高糖影响自噬的具体环节是抑制自噬流的降解阶段5.首次证实,Ⅰ型DMI中O-GlcNAc修饰抑制自噬流降解阶段的具体分子机制是:O-GlcNAc修饰通过阻碍复合物SNAP29-STX17-VAMP8的形成,从而抑制由该复合物介导的自噬流降解的过程。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R587.2;R542.2
【部分图文】：
前言转移酶(OGT)催化 GlcNAc基团从糖供体 UDP-GlcNAc转移到受体蛋白或苏氨酸残基上，而 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(OGA)则催化 GlcNAc 基饰蛋白上解离[30-34]。以上两种酶的共同作用使 O-GlcNAc 修饰处于动态态，同时 OGT 与 OGA 也是 O-GlcNAc 修饰研究的常用靶点[35]。已糖成过程如图 1 所示。
图 1.STZ 诱导的大鼠具有典型Ⅰ型 DM 表现饮食饮水增加；1d:STZ 组大鼠体重减轻。所有vs 同周龄 Vehicle 组大鼠；Vehicle 组大鼠:对Water intake:饮食饮水量；Body weight:体重；鼠周龄。
随周龄的增加， STZ 组大鼠心脏舒张功能明显减退，E/A 比值a,2c:4-week STZ 大鼠心脏彩超除 E/A 比值有下降外，其余各项参数与 Vehicle明显差异（n = 7/组）；2b,2d:8-week STZ 大鼠心脏舒张功能明显减退，E/A ，左室质量与左室舒张/收缩末容积明显增加。值均为平均值±标准差（n = 0.05 vs Vehicle 组，** P <0.01vs Vehicle 组.。4-week STZ 大鼠:经 STZ 诱导 4 周；8-week STZ 大鼠:经 STZ 诱导 8 周的 STZ 组大鼠；Vehicle 组大鼠:对照组大组大鼠的心肌组织结构改变如图 3a 所示，STZ 组大鼠血糖升高伴有明显的体重下降（P<0.05 vs 4-week STZ 大鼠的心脏重量（heart weight, HW）/体重（body weight无明显变化，但随着周龄推移，8-week STZ 大鼠 HW/BW 比值显0.05 vs Vehicle 组），提示心脏明显肥厚。与此同时，通过免疫组化法asson 染色）观察心肌形态，我们发现与 Vehicle 组相比，4-week ST组织结构无明显改变如图 3b,3c,3d,3e，而 8-week STZ 大鼠心肌细胞脂质沉积及心肌间纤维化明显增多如图 3f,3g,3h,3i。上述结果均提示
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 孙册;;Asn-连接的寡糖与肿瘤的发生和转移的相关性[J];生命的化学(中国生物化学会通讯);1989年05期
2 Mitsutaka Ogawa;Koichi Furukawa;Tetsuya Okajima;;Extracellular O-linked β-N-acetylglucosamine: Its biology and relationship to human disease[J];World Journal of Biological Chemistry;2014年02期
3 高婧;施美霞;寸镜芬;赵舒融;黄春荣;许艳华;;O-GlcNAc修饰调控软骨及成骨分化的研究进展[J];现代生物医学进展;2018年03期
4 于田;金东日;;新型N-糖链受体氘代MPDPZ-Boc-Asn-GlcNAc的合成及其受体性能[J];延边大学学报(自然科学版);2015年01期
5 汪素芳;韩荣弼;金东日;;新型N-连接糖链分析用试剂MMDPZ-Boc-Asn-GlcNAc的合成[J];化学试剂;2012年03期
6 李娟;王凤山;;O位N-乙酰葡糖胺修饰异常与胰岛素抵抗[J];生命的化学;2009年03期
7 潘丽晶;庞义;;O-连接的N-乙酰葡糖胺糖蛋白的研究进展[J];生物技术通报;2009年06期
8 Takeshi Sugai;New,Unexpected Pyranose-Furanose Rearrangement Towards the Synthetic Studies on Rare Sugars and Nucleosides[J];复旦学报(自然科学版);2005年05期
9 于春慧;张晓梅;李红丽;;O-GlcNAc化多肽的合成[J];北华大学学报(自然科学版);2008年04期
10 张旭,蔡良婉;新型O-连接糖基化——O-GlcNAc[J];国外医学(分子生物学分册);1994年05期
相关博士学位论文 前10条
1 杨庆;大型真菌凝集素的生物活性研究及应用[D];武汉大学;2017年
2 黄琳;O-GlcNAc糖基化修饰SNAP29蛋白抑制自噬降解加重Ⅰ型糖尿病心肌损伤[D];南昌大学;2018年
3 刘延峰;代谢工程改造枯草芽孢杆菌高效合成N-乙酰氨基葡萄糖[D];江南大学;2015年
4 李宏源;SKN-1蛋白的O-GlcNAc修饰调控秀丽隐杆线虫寿命及氧化应激作用机制的研究[D];东北师范大学;2017年
5 关婉怡;N-乙酰氨基葡萄糖/半乳糖核苷酸及类似物的酶法合成与应用研究[D];山东大学;2011年
6 房俊强;大肠杆菌K12 GlcNAc-1-P尿苷转移酶的研究[D];山东大学;2009年
7 宓文义;O-GlcNAc糖基化修饰在肿瘤发生与转移过程中的作用及其机制研究[D];中国海洋大学;2011年
8 顾玉超;O-GlcNAc修饰在乳腺癌转移过程中的作用及其机制研究[D];中国海洋大学;2008年
9 郭玉川;分枝硫醇合成相关糖基转移酶和磷酸酶的研究及肽连接酶Butelasel的异源表达[D];山东大学;2017年
10 具英花;氨基单糖—葡萄糖胺在内皮细胞活化调节中的作用[D];中国医科大学;2008年
相关硕士学位论文 前10条
1 沈绘;OGT对小鼠胚胎神经发生和神经发育的调控作用与分子机制研究[D];浙江大学;2018年
2 解锦;蛋白质O-GlcNAc糖基化高灵敏比色检测分析及生物学功能研究[D];西南大学;2017年
3 刘晓燕;OGT糖受体底物特异性和广泛性研究[D];南开大学;2014年
4 朱贵州;OGT催化HDAC1的O-GlcNAc修饰在肝细胞肝癌中的作用[D];南通大学;2016年
5 徐小芳;乙酰氨基葡萄糖合成关键酶GlmS和Gna1的筛选及催化动力学分析[D];江南大学;2016年
6 时照梅;蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰的规模化富集鉴定方法研究[D];安徽医科大学;2015年
7 崔银星;O-GlcNAc转移酶在肝细胞癌中的表达及临床意义[D];吉林大学;2014年
8 丛琦;蛋白质O-GlcNAc修饰研究的方法探讨[D];中国海洋大学;2012年
9 周洁雯;高效合成UDP-N-GlcNAc多酶体系的构建[D];浙江大学;2010年
10 颜金科;GlcNAc-BC共聚物的生物合成及其机理探究[D];海南大学;2012年
本文编号：
2836821
