维生素B6在小鼠心肌梗死后心功能恢复中的作用及机制研究

发布时间：2020-10-11 16:22

　　 背景:急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)发生的原因是冠状动脉急性闭塞,其具有突发性,病死率高、预后差等特点。梗死后缺血区血流灌注的恢复与患者预后情况密切相关,而血管新生、侧枝循环形成是心肌梗死后修复的重要途径,针对血管新生的治疗可以改善患者预后情况。内皮细胞迁移、增殖和小管形成在血管新生过程中至关重要,血管内皮生长因子(Vascular endothelial cell growth factor,VEGF)、成纤维细胞生长因子、血管生成素等均可促进血管新生,该过程受到多种信号转导途径调控。有文献报道,AMPK激活可引起p38MAPK磷酸化,增加VEGF mRNA稳定性及蛋白分泌,进而促进血管新生;另外,AMPK激活也可抑制糖氧剥夺引起的人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)凋亡。由此可见,AMPK活性与内皮细胞功能及血管新生密切相关。维生素B6(Vitamin B6,VitB6)在人体内常作为辅酶,参与多种代谢反应,例如糖异生及活性氧簇的清除,其缺乏可引起一些慢性疾病。有文献报道,长期VitB6缺乏者心血管事件发生率更高,预后更差,但其潜在机制仍未可知。也有文献报道,血循环VitB6低水平与C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)水平增高相关,而CRP水平可反应冠心病预后情况。另外VitB6可使炎症因子被快速清除,而在各种心血管事件中,均存在炎症过度激活。此前有文献报道,AMPK可通过激活AP-2α抑制NF-κb的活性,发挥抑制炎症的作用。因此,我们推测,充足的VitB6供给可通过激活AMPK抑制过度激活的炎症,上调心肌梗死后的血管新生,进而促进心肌梗死后的心功能恢复,改善预后情况。研究目的:1.研究VitB6是否可以激活AMPK;2.研究VitB6是否可以在体内体外改善HUVECs功能并促进血管新生;3.补充VitB6能否促进心肌梗死小鼠心功能恢复。研究内容及方法:1.不同浓度梯度及时间梯度VitB6刺激HUVECs,确定VitB6处理细胞的最适浓度及时间。2.检测VitB6处理后,HUVECs的AMPK磷酸化水平的改变。3.观察VitB6处理对HUVECs迁移功能的影响,HUVECs的迁移活力通过细胞划痕实验评估。4.观察VitB6干预对HUVECs增殖功能的影响,通过CCK-8和MTT试剂盒检测细胞增殖活力。5.观察VitB6处理对HUVECs小管形成功能的影响。6.Compound.C预处理抑制AMPK磷酸化后,观察VitB6对内皮细胞功能的影响是否继续存在。7.动物分组及模型建立:8周龄大的b129小鼠,随机分为2组,干预组给予2 mg/ml的VitB6饮水,14周后,所有小鼠采用高尔和手术法行左前降支结扎术,构建急性心肌梗死模型。8.小动物心脏超声:在心肌梗死后2周,使用小动物心脏超声评估小鼠梗死后心功能,通过超声心动图系统计算收缩或舒张的左心室内径(Left ventricular internal diameter at end-systole or end-diastole,LVIDs或LVIDd)、左室射血分数(Left ventricular ejection fraction,LVEF)和短轴缩短率(Fraction shortening,FS)。9.组织病理学染色:HE染色评估心肌梗死面积大小;梗死交界区CD31及α-SMA免疫组化评估新生血管密度。10.应用多因子检测试剂盒检测各组小鼠心肌梗死后2周血清炎症因子水平。11.蛋白免疫印迹(Western blot,WB)检测梗死区域心肌组织中AMPK活性和血管新生标志物水平。结果:1.0.5 mM的刺激浓度和24小时的刺激时间为VitB6作用于细胞的最适条件,该条件下,HUVECs的AMPK磷酸化程度最高。2.0.5 mM及1.0 mM VitB6刺激24小时后,HUVECs的迁移功能得到改善;3.0.5mM及1.0mM VitB6干预24小时后,CCK-8和MTT均未检测到细胞增殖能力的变化;4.0.5 mM及1.0 mM VitB6刺激24小时后,HUVECs小管形成能力增强。5.VitB6刺激可使细胞的VEGFA表达水平升高。6.AMPK抑制剂Compound.C预处理HUVECs后,VitB6刺激不引起AMPK磷酸化水平改变,同时对VEGFA的促进作用消失。7.Compound.C预处理可消除VitB6对细胞迁移及小管形成功能的促进作用。8.预先给予2 mg/ml的VitB6饮水,可减小小鼠心肌梗死面积百分比。9.预先VitB6干预后,小鼠心肌梗死后心功能较对照组改善,LVEF和FS均增加,而LVIDd和LVIDs较对照组小。10.预先VitB6干预后,小鼠心肌梗死与非梗死交界区新生血管密度较对照组增加。11.心肌梗死小鼠血清TNF-α水平和IL-6水平较对照组升高,VitB6干预可削弱该变化。12.VitB6干预组小鼠梗死区心肌组织蛋白中,AMPK磷酸化程度及VEGFA水平均较对照组升高。结论:1.VitB6在体内和体外均可激活AMPK;2.VitB6可改善HUVECs的迁移和成管功能,且该作用与激活AMPK相关;3.补充VitB6可促进小鼠心肌梗死后心功能恢复。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R542.22
【部分图文】：

ＶｉｔＢ６在ＨＵＶＥＣｓ中激活ＡＭＰＫ〇不同浓度的ＶｉｔＢ６朿ｌｊ激ＨＵＶＥＣＭＰＫ激活情况，０．５－１．０ｍＭ为最适浓度。ＡＶｉｔＢ６作用于ＨＵＶＥＭＰＫａ及总ＡＭＰＫａ的ＷＢ条带；Ｂ应用Ｉｍａｇｅ?Ｊ对Ａ图灰度值的分。（＊?＼／ｓ．Ｏ?ｍＭ?组，Ｐ?＜０．０５；?＊＊?＼／ｓ．Ｏ?ｍＭ?组，Ｐ?＜０．０１；?＊林?ｖｓ．Ｏ?．００１）??

?ＶｉｔＢ６促进ＨＵＶＥＣｓ小管形成功能。０．５?ｍＭ和１．０?ｍＭ?ＶｉｔＢ６干预２４小??时后，将细胞收集并接种于Ｍａｔｒｉｇｅｌ胶，观察ＨＵＶＥＣｓ小管形成能力，ＶｉｔＢ６??处理组小管形成能力增加。Ａ不同浓度ＶｉｔＢ６刺激２４小时后细胞第６小时小管??形成情况，图为５次独立实验的代表性图片，上半部分放大倍数为４〇ｘ，下半部??分放大倍数为１〇〇ｘ；?Ｂ?Ｉｍａｇｅ」分析后每低倍视野的小管形成节点数统计分??析；Ｃ每低倍视野总节段长度的统计分析。（＊ｖｓ．?Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｐ＜０．０５）??

?ＶｉｔＢ６对ＨＵＶＥＣｓ增殖功能无明显影响。０．?５?ｍＭ和１．?０?ｍＭ?ＶｉｔＢ６干预ＨＵＶＥＣｓ??２４ｈ后，应用ＣＣＫ－８及ＭＴＴ检测细胞活力，ＶｉｔＢ６处理组增殖能力无明显变化。Ａ??不同浓度ＶｉｔＢ６刺激ＨＵＶＥＣｓ后ＣＣＫ－８检测细胞增殖能力的统计，对照组设定为??１，三组之间无统计学差异；Ｂ不同浓度ＶＵＢ６刺激ＨＵＶＥＣｓ后ＭＴＴ检测细胞增殖??能力的统计，对照组设定为１，三组之间无统计学差异。??
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本文编号：2836831