背景心肌梗死(myocardial infarction,MI)是指心肌的缺血缺氧性坏死,是在冠状动脉病变的基础上(如冠状动脉粥样硬化),冠状动脉的血流急剧减少或中断(如斑块破裂),使得该冠脉供血的心肌出现严重地急性缺血缺氧,最终导致心肌的缺血性坏死。心肌梗死是心血管疾病致死致残的主要原因。我国每年死于急性心肌梗死的患者高达百万[1]。心梗后心脏组织发生严重的病理生理变化包括炎症、凋亡、心肌肥大和纤维化,这些病理变化引起梗死后心脏重构、心衰、心律失常甚至心脏性猝死。近年来随着溶栓、心脏介入手术的广泛开展、药物治疗的迅猛发展以及生活方式的改变,心梗死亡率明显下降且预后得以改善[2]。虽然大部分患者在接受PCI治疗后预后不错,但一些患者仍会发生心室重构(ventricular remodeling,VR)。结构重构(structural remodeling)、电重构(electrical remodeling)、与心力衰竭(heart failure,HF)的发展及室性心律失常的发生密切相关[3]。心梗后心脏重构涉及多因素、多分子,错综复杂;其发生的根本机制尚不确切。因此,对于心梗后心脏重构的机制研究仍任重道远,如何延缓心梗后病理生理进程、改善心梗后心脏重构对心梗的治疗起着至关重要作用。趋化因子及其受体在心血管疾病中的作用备受研究者们的关注,并被证实发挥重要作用:CCL2/CCR2参与动脉粥样硬化及心梗病理生理,药物抑制或基因控制CCL2/CCR2信号轴可削弱炎症抑制心室不利重构[4];CCL21/CCR7在心梗后心室重构中发挥重要作用,CCL21中和抗体能改善心梗后心室重构;动脉粥样硬化的发生发展需要CCR1、CCR5参与招募单核细胞。趋化因子受体9(CCR9)是小分子G蛋白偶联受体,只有一个己知的配体趋化因子25(CCL25)。CCR9是近年来发现的新的趋化因子受体,主要表达在淋巴细胞,树突状细胞及单核巨噬细胞细胞膜上[5]。有关CCR9与心血管疾病的报导甚少,但其在其他系统炎症性疾病中均发挥作用。炎症反应、炎症细胞、细胞因子、趋化因子是心梗后病理生理的主角,引导着心梗后心室重构的走向。因而本课题拟以心梗小鼠为模型探讨CCR9在心肌梗死后心室重构中的作用,并通过敲除CCR9基因观察其对心梗后心室重构的影响,以期为心梗的临床治疗及改善预后提供新的思路及实验依据。第一部分:CCL25/CCR9参与心肌梗死后心脏重构的研究目的:探讨CCL25/CCR9是否参与心梗后心室重构。方法:选择体重在24-27g,8-10周龄的C57BL/6雄性野生型小鼠(wild type,WT)通过结扎冠状动脉左前降支建立小鼠心梗模型,实验对象分三组:假手术组(Sham 组),心梗后 3 天组(MI/3d),心梗后 1 周组(MI/1W)。RT-PCR 及 Western blot检测CCR9及CCL25在梗死心肌组织中的表达水平。免疫组化法检测CCR9及CCL25表达水平及表达部位。免疫荧光双标记法检测表达CCR9的细胞种类。结果:与sham组相比,RT-PCR及Western blot检测显示心梗后3天和1周的小鼠心肌组织中的CCR9和CCL25表达显著升高(P0.01)。免疫组化也显示CCR9及CCL25表达显著升高,并且主要表达在梗死区及梗死周边区。免疫荧光双标记法进一步显示CCR9主要表达于CD68+和CD3+细胞表面。结论:心梗后心肌组织中CCR9及CCL25表达显著升高,并且主要表达于梗死区及梗死周边区的CD68+和CD3+细胞表面,我们由此推测CCR9及CCL25参与了心梗后的病理过程,可能通过参与炎症反应影响心室重构。第二部分:CCR9基因敲除对小鼠心梗后心室结构重构的影响及机制目的:探讨CCR9基因敲除对小鼠心梗后心室结构重构的影响及机制方法:选择体重在24-27g,8-10周龄的CCR9基因敲除(CCR9-/-)小鼠和同窝野生型小鼠(CCR9+/+)建立小鼠心梗模型,实验对象分四组:野生型小鼠假手术组(CCR9+/+Sham组),基因敲除小鼠假手术组(CCR9-/-Sham组),野生型小鼠心梗后1W组(CCR9+/+ MI1W组),基因敲除小鼠心梗后1W组(CCR9-/-MI1W组)。模型成功后,每天观察各组小鼠的生存状态,统计死亡数量,绘制生存曲线图。超声心动图评价心肌梗死后1W小鼠心功能。测定小鼠体重(body weight,BW)、心脏重量(heart weight,HW)、肺脏重量(lung weight,LW)及胫骨长度(tibia length,TL)。HE染色用于观察梗死周边区心肌细胞大小形态及测量心肌梗死面积,天狼星红染色用于观察心肌间质胶原沉积及胶原容积分数的计算。RT-PCR检测梗死周边区心肌组织中肥大相关指标(ANP、BNP、β-MHC)及纤维化指标(CTGF、CollageI、CollageIII)的RNA水平。WB检测梗死周边区心肌组织中MAPK信号通路相关蛋白——ERK1/2,JNK1/2,P38的总蛋白水平及磷酸化水平。结果:与Sham组相比,心梗小鼠生存率显著下降(P均0.05),CCR9-/-MI 1W组小鼠生存率较CCR9+/+ MI 1W组生存率有改善趋势。HE染色显示CCR9-/-MI 1W组小鼠心梗面积较CCR9+/+MI 1W组显著减小(P0.05)。超声心动图显示,与Sham组相比,心梗后一周小鼠心脏功能显著下降,左室舒张末期内径(LVEDd)、左室收缩末期内径(LVSDd)显著增加(P均0.05),短轴缩短率(FS)及左室射血分数(LVEF)均降低(P均0.05)。但CCR9-/-MI1W组小鼠心脏功能较CCR9+/+ MI 1W组显著改善,左室舒张末期内径(LVEDd)、左室收缩末期内径(LVSDd)显著减小(P均0.05),短轴缩短率(FS)及左室射血分数(LVEF)均升高(P均0.05)。与 Sham 组相比,CCR9+/+MI1W HW/BW、LW/BW、HW/TL 显著增加(P 均0.05),与 CCR9+/+ MI 1W 组相比,CCR9-/-MI 1W 组 HW/BW、LW/BW、HW/TL均有所降低(P均0.05)。与Sham组相比,HE染色显示CCR9+/+MI 1W组心肌细胞横截面积显著增加(P0.05),与CCR9+/+MI 1W组相比,CCR9-/-MI 1W组心肌细胞横截面积减小(P0.05),且形态趋于正常。与Sham组相比,CCR9+/+ MI 1W组心肌肥大相关指标ANP、BNP、β-MHC表达升高(P0.05),与CCR9+/+ MI 1W组相比,CCR9-/-MI 1W组心肌肥大相关指标ANP、BNP、β-MHC表达降低(P0.05)。与Sham组相比,PSR染色显示CCR9+/+ MI 1W组心肌间质胶原沉积显著增加(P0.05),与CCR9+/+MI 1W组相比,CCR9-/-MI 1W组心肌间质胶原沉积减少(P0.05)。与Sham组相比,CCR9+/+MI 1W组纤维化相关指标 CTGF、CollageI、CollageIII 表达升高(P0.05),与 CCR9+/+MI1W 组相比,CCR9-/-MI1W 组纤维化相关指标 CTGF、CollageI、CollageIII表达降低(P0.05)。与Sham组相比,Westernblot结果显示CCR9+/+ MI 1W组梗死周边区心肌组织中MAPK信号通路相关蛋白——ERK1/2,JNK1/2,P38的磷酸化表达水平显著升高(P0.05),与CCR9+/+MI1W组相比,CCR9-/-MI1W组ERK1/2,JNK1/2,P38的磷酸化表达水平降低(P0.05)。结论:CCR9参与小鼠心梗后心室结构重构,CCR9基因敲除减小心梗面积,改善心功能,改善小鼠心梗后生存率。CCR9基因敲除改善心梗后心肌肥大和心肌纤维化。CCR9基因通过调节MAPK信号通路参与心梗后心室结构重构调节。第三部分:CCR9基因敲除对小鼠心肌梗死后炎症反应及心肌细胞凋亡的影响及机制目的:探讨CCR9基因敲除对小鼠心梗后炎症反应及心肌细胞凋亡的影响及机制方法:选择体重在24-27g,8-10周龄的CCR9基因敲除(CCR9-/-)小鼠和同窝野生型小鼠(CCR9+/+)建立小鼠心梗模型,实验对象分四组:野生型小鼠假手术组(CCR9+/+Sham组),基因敲除小鼠假手术组(CCR9-/-Sham组),野生型小鼠心梗后IW组(CCR9+/+ MI 1W组),基因敲除小鼠心梗后1W组(CCR9-/-MI1W组)。模型成功后,免疫组化法检测梗死边缘区心肌组织中巨噬细胞及T淋巴细胞的变化;RT-PCR检测小鼠梗死周边区心肌组织中炎症因子IL-1β、TNF-a、IL-6 RNA的表达水平;western blot检测NF-kB信号通路蛋白——p65和IkBa蛋白激酶的总蛋白及磷酸化表达水平。结果:与Sham组相比,CCR9+/+ MI 1W组心梗周边区CD68及CD3阳性细胞浸润数量增加(P0.05),与CCR9+/+MI1W组相比,CCR9-/-MI1W组CD68及CD3阳性细胞浸润数量减少(P0.05)。与Sham组相比,CCR9+/+ MI 1W组组心梗周边区IL-1β、TNF-a、IL-6RNA的表达升高(P0.05),与CCR9+/+MI 1W组组相比,CCR9-/-MI1W组心梗周边区IL-IP、TNF-a、IL-6RNA的表达降低(P0.05)。与Sham组相比,Western blot结果显示CCR9+/+ MI 1W组梗死周边区心肌组织中NF-kB信号通路蛋白——p65和IkBa蛋白激酶的磷酸化表达水平显著升高(P0.05),与CCR9+/+ MI 1W组组相比,CCR9-/-MI 1W组p65和IkBa的磷酸化表达水平降低(P0.05)。结论:CCR9通过参与NF-kB信号通路调节心梗后炎症反应。CCR9基因敲除可减轻心梗后炎症反应,从而改善心梗后心室结构重构。第四部分:CCR9对小鼠心肌梗死后心脏电重构的影响及机制目的:探讨CCR9基因敲除对小鼠心梗后心脏电重构的影响及机制方法:选择体重在24-27g,8-10周龄的CCR9基因敲除(CCR9-/-)小鼠和同窝野生型小鼠(CCR9+/+)建立小鼠心梗模型,实验对象分四组:野生型小鼠假手术组(CCR9+/+Sham组),基因敲除小鼠假手术组(CCR9-/-Sham组),野生型小鼠心梗后1W组(CCR9+/+ MI 1W组),基因敲除小鼠心梗后1W组(CCR9-/-MI1W组)。模型成功后,遥测心电图技术检测24h动态心电图观察心率及心律失常发生情况;运用Langendorff离体电生理技术,对离体心脏给予SIS1程控刺激检测动作电位时程,动作电位电交替和室性心律失常诱发情况;western blot检测心梗周边区心肌组织缝隙连接蛋白CX43表达水平。结果:与Sharm组相比,CCR9+/+ MI 1W组及CCR9-/-MI 1W组RR间期、PR间期无差异(P0.05),QRS间期、QT间期及QTc间期均延长(P0.05),但CCR9+/+ MI 1W组与CCR9-/-MI 1W组间无差异。与sham组相比,CCR9+/+MI1W 组 APD90(PCL=150ms)显著延长(P0.05),与 CCR9+/+MI1W 组相比,CCR9-/-MI1W 组 APD90(PCL=150ms)缩短(P0.05)。与 sham 组相比,CCR9+/+MI1W组动作电位时程电交替诱发阈值明显降低(P0.05),与CCR9+/+ MI 1W组相比,CCR9-/-MI 1W组动作电位时程电交替诱发阈值升高(P0.05)。与sham组相比,CCR9+/+MI1W组室性心律失常诱发率明显升高(P0.05),与CCR9+/+MI 1W组相比,CCR9-/-MI 1W组室性心律失常诱发率降低(P0.05)。与sham组相比,CCR9+/+MI1W组心梗周边区心肌组织缝隙连接蛋白CX43表达降低(P0.05),与CCR9+/+ MI 1W组相比,CCR9-/-MI1W 组 CX43 表达升高(P0.05)。结论.· CCR9基因敲除可能通过抑制缝隙连接蛋白CX43降解,减轻心肌细胞解偶联,从而抑制心律失常发生。
【学位单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R542.22
【部分图文】：
?免疫组化结果显示：与ｓｈａｍ组相比，小鼠心梗后３ｄ及１Ｗ心室ＣＣＲ９和??ＣＣＬ２５表达水平显著升高，且主要表达于心梗区和梗死周边区（图１Ａ）。??４．?ＣＣＲ９主要表达于心梗后梗死区和梗死周边区ＣＤ３＋和ＣＤ６８＋细胞??表面??免疫荧光双标记结果显示：ＣＣＲ９主要表达于心梗后梗死区和梗死周边区??ＣＤ３＋和ＣＤ６８＋细胞表面，即Ｔ细胞和巨噬细胞表面，另外血管内皮细胞也有少??量阳性表达，而心肌细胞未见阳性表达（图１Ｄ）。??讨论??为了探讨ＣＣＲ９是否参与心肌梗死后的病理生理过程，我们首先检测了野??生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠急性心梗后不同时间点ＣＣＲ９及其配体ＣＣＬ２５表达情况。免??疫组化，实时荧光定量ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ结果表明，ｓｈａｍ组小鼠心室组织ＣＣＲ９??及ＣＣＬ２５表达不明显，心梗后小鼠心室组织ＣＣＲ９及ＣＣＬ２５表达水平显著升高，??且心梗后１Ｗ表达水平更高。这些实验结果充分提示ＣＣＲ９参与心梗后的病理生??理过程。为了明确ＣＣＲ９表达于心梗后心脏的哪些部位及何种细胞，我们通过免??疫组化及免疫双焚光标记发现，ＣＣＲ９主要表达于心梗后梗死区及梗死周边区的??ＣＤ３＋细胞和ＣＤ６８＋细胞
?免疫组化结果显示：与ｓｈａｍ组相比，小鼠心梗后３ｄ及１Ｗ心室ＣＣＲ９和??ＣＣＬ２５表达水平显著升高，且主要表达于心梗区和梗死周边区（图１Ａ）。??４．?ＣＣＲ９主要表达于心梗后梗死区和梗死周边区ＣＤ３＋和ＣＤ６８＋细胞??表面??免疫荧光双标记结果显示：ＣＣＲ９主要表达于心梗后梗死区和梗死周边区??ＣＤ３＋和ＣＤ６８＋细胞表面，即Ｔ细胞和巨噬细胞表面，另外血管内皮细胞也有少??量阳性表达，而心肌细胞未见阳性表达（图１Ｄ）。??讨论??为了探讨ＣＣＲ９是否参与心肌梗死后的病理生理过程，我们首先检测了野??生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠急性心梗后不同时间点ＣＣＲ９及其配体ＣＣＬ２５表达情况。免??疫组化，实时荧光定量ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ结果表明，ｓｈａｍ组小鼠心室组织ＣＣＲ９??及ＣＣＬ２５表达不明显，心梗后小鼠心室组织ＣＣＲ９及ＣＣＬ２５表达水平显著升高，??且心梗后１Ｗ表达水平更高。这些实验结果充分提示ＣＣＲ９参与心梗后的病理生??理过程。为了明确ＣＣＲ９表达于心梗后心脏的哪些部位及何种细胞，我们通过免??疫组化及免疫双焚光标记发现，ＣＣＲ９主要表达于心梗后梗死区及梗死周边区的??ＣＤ３＋细胞和ＣＤ６８＋细胞
图２：?ＣＣＲ＾基因敲除降低心梗后小鼠死亡率、减小心梗面积、改善心功能。（Ａ）??ＣＣＲ９＋／＋和ＣＣＲ９－／－假手术及心梗后１周各组小鼠生存曲线；（Ｂ）各组小鼠心脏??组织ＨＥ染色及心梗后３天、１周梗死区面积；（Ｃ）心梗面积统计柱状图（ｎ＝５，??＊Ｐ＜０．０５?ＶＳ．ＣＣＲ９＋／＋ＭＨＷ）；?（Ｄ）心梗１周后小鼠心脏超声检测结果（ｎ＝８－１０，??＊Ｐ＜?０．０５?ｖｓ．?ＣＣＲ９＋／＋?ｓｈａｍ?组，＃Ｐ＜?０．０５?ｖｓ．?ＣＣＲ９＋／＋?ＭＩ?１Ｗ?组）。??２７??
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2848605
