miR-22对主动脉夹层发生和管壁生物力学性质的影响及机制研究

发布时间：2020-10-20 14:03

　　 研究目的我们通过基因芯片筛选检测发现miR-22在主动脉夹层患者主动脉组织样本中的表达较正常主动脉组织样本中显著下调。在动物实验中,通过主动脉夹层造模研究miR-22对主动脉夹层发生、管壁生物力学性质及力学性质相关蛋白表达的影响。在细胞实验中,通过干预平滑肌细胞、内皮细胞内miR-22的表达检测其对平滑肌细胞、内皮细胞增殖、凋亡功能和力学相关蛋白表达的影响;在内皮细胞和平滑肌细胞非接触共培养模型中,通过干预内皮细胞中miR-22的表达后检测平滑肌细胞中力学相关蛋白含量,以及通过干预内皮细胞分泌功能后检测平滑肌细胞中力学相关蛋白含量,以揭示miR-22影响主动脉管壁生物力学性质和主动脉夹层发生的机制。研究方法根据前本中心前期芯片结果,我们筛查了在人组织样本中差异表达的miRNAs,并通过realtime PCR验证miR-22在主动脉夹层样本中较正常主动脉组织样本中显著下调。在动物实验中,我们利用3周龄雄性FVB小鼠进行主动脉夹层造模,采用饮用水中添加β-氨基丙腈喂养,持续喂养1个月后,给予尾静脉注射miR-22Agomir/antagomir,继续喂养一周后,在小鼠皮下植入血管紧张素II微泵持续72h建立主动脉夹层模型。造模结束后,取小鼠主动脉组织样本,在大体标本上观察主动脉病变情况,记录主动脉夹层发生率;小鼠主动脉标本切片HE染色测量主动脉中膜厚度、管腔直径并计算中膜厚度管径比值,小鼠主动脉标本切片EVG染色测量管壁弹力纤维含量,小鼠主动脉标本切片Masson染色测量管壁胶原纤维含量,以检测miR-22对主动脉管壁血管重构的影响;利用力学测试系统对小鼠主动脉进行力学测试,记录主动脉厚度、周长、刚度、极限荷载、极限位移、极限应力、极限应变、拉伸比的数值,绘制应力应变曲线,结合Origin软件通过线性拟合分析计算其弹性模量,以此明确miR-22对主动脉管壁力学性质的影响;主动脉组织TUNEL染色法检测miR-22对管壁细胞凋亡的影响;免疫组织化学的方法检测miR-22对管壁力学相关蛋白Rho/ROCK1表达的影响。在细胞实验中,构建miR-22上调和下调腺病毒,分别感染平滑肌细胞和内皮细胞,用CCK-8法检测细胞增殖功能变化;利用Annexin V-APC及7-AAD双染色后流式细胞仪检测细胞凋亡。干预平滑肌细胞miR-22表达后,提取细胞总蛋白,利用western-blot检测miR-22对平滑肌细胞力学相关蛋白Rho/ROCK1表达的影响。利用生物信息学方法预测miR-22可能靶向作用的分泌型蛋白,通过ELISA检测干预miR-22的内皮细胞培养液中蛋白的表达情况以确定miR-22作用的靶蛋白FBXW7。在内皮细胞和平滑肌细胞的非接触共培养模型中,干预内皮细胞的miR-22表达后,提取平滑肌细胞总蛋白,利用western-blot检测miR-22作用于内皮细胞对平滑肌细胞力学相关蛋白Rho/ROCK1的表达的影响。合成用于敲减内皮细胞中分泌蛋白FBXW7的siRNA,对共培养模型中的内皮细胞进行干预,检测平滑肌细胞中力学相关蛋白的表达量,明确miR-22是否通过影响内皮细胞分泌功能进而改变平滑肌细胞中力学相关蛋白ROCK1的表达。结果通过人主动脉组织样本realtime PCR验证我们发现miR-22在主动脉夹层组织中的表达较正常主动脉组织样本中显著下调。动物实验结果显示:主动脉夹层造模率mir-22上调组为4/12(33.3%),上调对照组为8/12(66.7%),mir-22下调组为7/12(58.3%),下调对照组为5/12(41.7%)。经统计学分析表明,mir-22上调组与上调对照组相比可显著降低主动脉夹层的发生率。对小鼠主动脉组织样本HE染色进行测量并对结果进行统计分析发现agomir-22组较agomir-NC组小鼠中膜厚度管径比值明显增大;对EVG染色测量结果进行统计并分析发现agomir-22组较agomir-NC组弹力纤维含量显著增高;对本Masson染色测量结果进行统计并分析发现agomir-22组较agomir-NC组胶原纤维含量显著增高。免疫组化结果提示小鼠主动脉组织中力学相关Rho、ROCK1的表达量,miR-22上调组较miR-22下调组明显降低。小鼠主动脉管壁力学测试结果显示:agomir-22组较agomir-NC组管壁平均厚度显著增加,小鼠主动脉管壁周长各组间无明显差异;agomir-22组与agomir-NC组相比,极限荷载、极限位移、极限应力、极限应变、初始弹性模量、拉伸比均显著升高,而极限弹性模量、曲线下面积无明显统计学差异;antagomir-22组较antagomir-NC组极限荷载、极限应力、极限弹性模量、刚度等均降低,而极限位移、极限应变、拉伸比、曲线下面积、初始弹性模量无明显统计学差异,力学实验结果表明miR-22表达上调在夹层发生中起到了保护性作用。细胞实验结果:干预平滑肌细胞和内皮细胞中的miR-22后检测细胞功能,结果显示,下调miR-22可显著抑制平滑肌细胞的增殖功能、促进其凋亡,同时干预miR-22对平滑肌细胞力学相关蛋白Rho/ROCK1含量无影响。干预miR-22对内皮细胞增殖、凋亡无影响。通过生物信息学方法我们预测了miR-22可能靶向作用的分泌型蛋白FBXW7和TMED4。收集干预miR-22的内皮细胞的培养液,利用ELISA检测其中FBXW7和TMED4的含量,发现miR-22上调可显著降低FBXW7的含量,下调miR-22可显著提高FBXW7的含量,而干预miR-22对TMED4的含量没有影响。在内皮细胞和平滑肌细胞无接触共培养模型中干预内皮细胞miR-22的表达后测定平滑肌细胞中力学相关蛋白Rho/ROCK1含量,结果显示下调内皮细胞中miR-22的表达可使平滑肌细胞中ROCK1含量升高。而后我们合成了用于敲减FBXW7表达的siRNA,在共培养模型中干预miR-22下调组内皮细胞,随后检测平滑肌细胞的ROCK1表达情况,结果表明敲减内皮细胞中FBXW7可以削弱miR-22下调引起的平滑肌细胞中ROCK1蛋白表达量的升高。结论本课题主要研究了miR-22影响主动脉管壁力学性质及其在主动脉夹层发生的中的作用和机制。1.miR-22在夹层主动脉组织中较正常主动脉组织显著下调;2.miR-22表达上调可使小鼠主动脉夹层的发生率降低;3.通过力学检测发现上调miR-22可以显著提高主动脉管壁极限荷载、极限位移、极限应力、极限应变、初始弹性模量、拉伸比等生物力学指标;4.免疫组化结果提示下调miR-22可使小鼠主动脉Rho/ROCK1含量增高;5.下调mir-22对平滑肌细胞增殖功能具有抑制作用,对凋亡能力具有促进作用,但是干预miR-22对平滑肌细胞的力学相关蛋白含量无影响。6.miR-22对内皮细胞的增殖、凋亡功能没有影响;7.上调miR-22可以抑制内皮细胞分泌FBXW7,对TMED4的分泌没有影响;8.在内皮细胞和平滑肌细胞非接触共培养模型中下调内皮细胞的miR-22可使平滑肌细胞中力学相关蛋白ROCK1含量增加;9.miR-22通过影响内皮细胞分泌FBXW7,间接作用于平滑肌细胞使其力学相关蛋白ROCK1的表达发生改变。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R543.1
【部分图文】：

图 1 小鼠主动脉力学测试示意图在样本浸泡在盛有生理盐水的培养皿中，在体式显微镜下进行处理；本穿在自制夹具上并固定于力学测试仪的夹具上鼠主动脉环的单轴拉伸力学测试操作流程主动脉环用两个自制碳素钢丝模具分别穿过，然后将上下两端分别固器夹具上，因自制模具较细小，可在咬合处加用磨砂纸增加摩擦力（图电脑控制系统上将荷载及初始位移位置的读数归零；具两端用仪器配送扳手旋紧，确保拉伸过程中被测样本不会出现滑脱制操作系统开始测量后，系统将开始运行并自动记录运行过程中的实值；动脉环断裂后，系统将继续运行，移动至预设位移处自动停止。鼠主动脉管壁形态学测量验中小鼠主动脉管壁厚度 T0 及小鼠主动脉管壁周长计算方法：通过

miR-22 对主动脉夹层发生和管壁生物力学性结果-22 在人主动脉夹层组织样本中显著下主动脉夹层 miRNA 差异表达的芯片结果，我s，并利用收集的主动脉夹层患者及正常捐献者 RNA，逆转录得到 cDNA，最后进行 RealtimeiR-491-3p、miR-1284、miR-30a、miR-130a 在人R 实验结果，我们发现与正常主动脉组织相比，调（P<0.05），而 miR-491-3p、miR-1284、mi

文应的 miR-22 干预剂，继续喂养一周后，除空组皮下植泵血管紧张素Ⅱ。脉 miR-22 干预效果验证静脉注射 miR-22 干预剂（agomir-22/antagom影响，小鼠尾静脉注射一周后处死小鼠，取小PCR 验证。图 3 表明，agomir -22 组与 agomir-N差异具有显著统计学意义（P<0.05），而 anta，可显著下调小鼠主动脉 miR-22 的表达，差agomir/antagomir 干预方法有效。
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本文编号：2848778