第一部分 建立胸腔闭合式小鼠心肌缺血再灌注损伤模型研究背景:缺血性心脏病是引起全球人口死亡的第一位因素,严重威胁人类健康。缺血再灌注损伤加重心肌损害,是导致疾病预后不良的重要因素。因此,探寻防治缺血再灌注损伤的有效治疗方法有利于改善缺血性心脏病患者预后。本实验将建立不同于以往胸腔开放式模型,拟建立一种胸腔闭合式小鼠心肌缺血再灌注损伤模型,以期减少手术创伤应激对心肌缺血再灌注损伤实验的影响,从而为探寻治疗药物提供基础。目的:建立一种胸腔闭合式小鼠心肌缺血再灌注损伤模型。方法:采用10-12周龄C57BL/6野生型雄性小鼠,异氟醚麻醉后行气管插管接呼吸机通气,显微镜下沿左锁骨中线第四肋间隙开胸,建立心肌缺血再灌注损伤预模型;待小鼠复苏后,常规饲养5天,再在静脉麻醉下行缺血再灌注损伤实验;分别予以缺血30 min或60 min,再灌注2 h或24 h,取小鼠心脏,TTC染色检测心肌梗死面积或者TaqMan探针Real-Time PCR技术测定心肌组织炎症因子表达水平。结果:(1)胸腔闭合式小鼠心肌缺血再灌注模型可成功诱导心肌梗死。缺血30min,再灌注2h或24h后,TTC染色观察到小鼠心肌梗死发生,并且再灌注24h较2h心梗面积增加;缺血30 min或60 min后,再灌注24 h后,TTC染色观察到小鼠心肌梗死发生,但是缺血60min与30min比较,心肌梗死面积无显著差异;(2)缺血再灌注损伤显著增加心肌组织炎症因子水平。小鼠心肌缺血30 min,再灌注2 h后,胸腔闭合式心肌缺血再灌注预模型小鼠(术后恢复5天后,sham组)与正常健康小鼠相比(contol组)其炎症因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6均无明显变化;但是,缺血再灌注损伤小鼠(I/R组)心肌组织IL-1β、IL-6水平显著高于sham组和control组小鼠。结论:成功建立胸腔闭合式小鼠心肌缺血再灌注损伤模型,为后续实验建立了研究基础。第二部分 CpG-ODN后处理在心肌缺血再灌注损伤中的保护作用研究研究背景:缺血后处理(ischemic postconditioning,IPC)是只在缺血发生后,再灌注前或者再灌注起始阶段,进行反复多次的短暂血流阻断与恢复处理。研究证实IPC与缺血预处理一样,能够诱导并启动机体内源性保护机制,对心肌缺血再灌注损伤发挥保护作用。CpG-ODN是TLR9的配体,具体调节机体免疫炎症功能。研究表明CpG-ODN预处理能够减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤心肌梗死面积,改善小鼠心脏功能。但是,CpG-ODN后处理是否具有同样作用,尚不清楚。目的:探讨CpG-ODN后处理在小鼠心肌缺血再灌注损伤中的保护作用。方法:为了探讨CpG-ODN后处理对小鼠心肌缺血再灌注损伤早期预后的保护作用,实验分为三个组,分别为①PBS组:在恢复再灌注前5 min给予腹腔注射PBS 250μl;②IPC组:在完成缺血30 min后,给予再灌注20 s后紧接着缺血20 s,循环3次;③CpG-ODN组:在恢复再灌注前5 min给予腹腔注射CpG-ODN(0.2 μmol/kg,溶解于250μl PBS中)。所有实验组小鼠在完成缺血30min,再灌注2h和24h后,取小鼠心脏,TTC染色检测小鼠心肌梗死面积;并且在再灌注24 h后通过置入左心室P-V导管评估小鼠的心脏功能。为了探讨CpG-ODN对小鼠心肌缺血再灌注损伤远期预后的保护作用,实验分为四个组,分别为①sham组:小鼠只进行缺血再灌注损伤预模型的建立,并不行缺血再灌注干预;①PBS组:在恢复再灌注前5 min给予腹腔注射PBS 250 μl;②IPC组:在完成缺血30 min后,给予再灌注20s后紧接着缺血20s,循环3次;③CpG-ODN组:在恢复再灌注前5 min给予腹腔注射CpG-ODN(0.2 μmol/kg,溶解于250 μ1 PBS中)。除sham组外,其它实验组小鼠在完成缺血30 min,再灌注7 days和28 days后,取小鼠心脏,天狼星红染色法检测心肌组织胶原纤维沉积水平,评估心肌纤维化程度;再灌注3 days和7 days后,取小鼠心脏,免疫组化检测心肌组织巨噬细胞浸润程度;再灌注3 days、7 days和28 days后通过置入左心室P-V导管评估小鼠的心脏功能。结果:(1)与PBS组相比,CpG-ODN后处理和IPC处理均显著降低小鼠再灌注2h和24 h心肌梗死面积。(2)与PBS组相比,CpG-ODN后处理显著增加小鼠再灌注24 h左心室功能指标包括射血分数(ejection fraction,EF)和前负荷补充搏功(preload recruitable stroke work,PRSW),改善小鼠心脏功能;(3)与PBS组相比,CpG-ODN后处理和IPC显著降低小鼠再灌注后7 days和28 days心肌组织胶原纤维沉积;(4)与PBS组相比,CpG-ODN后处理显著减少小鼠再灌注后3 days和7 days心肌组织巨噬细胞浸润,IPC处理仅显著减少小鼠再灌注后3 days心肌组织巨噬细胞浸润;(5)与PBS组相比,CpG-ODN显著增加小鼠再灌注后3 days、7 days和28 days EF和PRSW值,显著改善小鼠心脏功能;IPC处理仅增加小鼠再灌注3 days EF和PRSW值。结论:CpG-ODN不仅减少心肌缺血再灌注损伤小鼠心肌梗死面积,改善早期心脏功能,而且降低小鼠心肌组织胶原纤维沉积和巨噬细胞浸润,改善远期心脏功能。第三部分 CpG-ODN后处理对心肌缺血再灌注损伤保护作用的机制研究研究背景:再灌注损伤救援激酶(reperfusion injury salvage kinase,RISK)包括 PI3K/Akt、MAPKs和ERK1/2等被认为是缺血后处理(ischemicpostconditioning,IPC)改善心肌缺血再灌注损伤预后的关键信号机制。CpG-ODN作为一种人工合成的模拟细菌DNA成分的寡聚脱氧核苷酸,与其受体TLR9(Toll like receptor 9,TLR9)结合后,参与调节机体免疫炎症反应。研究发现CpG-ODN预处理通过活化PI3K/Akt信号通路和调节IL-10炎症因子,从而减少缺血再灌注损伤小鼠心肌梗死面积,改善小鼠心脏功能。然而,CpG-ODN后处理对心肌缺血再灌注损伤保护作用的机制如何,尚不清楚。目的:探讨CpG-ODN后处理减轻小鼠心肌缺血再灌注损伤的作用机制。方法:实验将分为三个组,分别为①PBS组:在恢复再灌注前5 min给予腹腔注射PBS 250 μl;②IPC组:在完成缺血30 min后,给予再灌注20s后紧接着缺血20s,循环3次;③CpG-ODN组:在恢复再灌注前5 min给予腹腔注射CpG-ODN(0.2μmol/kg,溶解于250 μl PBS中)。在完成缺血30 min,再灌注2 h后,取小鼠心脏,TaqMan探针Real-Time PCR技术检测心肌组织炎症因子水平;进一步,采用C57BL/6野生型雄性(WT)小鼠以及同系来源的TLR9基因敲除(TLR9-D)小鼠作为研究对象,并且部分WT小鼠采用PI3K抑制剂wortmannin进行干预,完成缺血30min,再灌注2h后,取小鼠心脏,TTC染色检测小鼠心肌梗死面积。结果:(1)与IPC组或PBS组相比,CpG后处理显著诱导小鼠再灌注2 h后心肌组织炎症因子IL-10表达升高;(2)在WT小鼠中,CpG-ODN后处理显著减轻小鼠再灌注2h后心肌梗死面积;然而,在TLR9-D小鼠中,CpG-ODN未能减少缺血再灌注损伤小鼠心肌梗死面积;(3)DMSO预处理对照组小鼠中,CpG-ODN和IPC均显著减少缺血再灌注损伤小鼠心肌梗死面积;然而,在wortmannin预处理小鼠中,CpG-ODN和IPC未能减少缺血再灌注损伤小鼠心肌梗死面积。结论:CpG-ODN后处理显著诱导心肌组织抗炎因子IL-10表达升高,并且CpG-ODN对心肌缺血再灌注损伤小鼠的保护作用被TLR9基因敲除和PI3K抑制剂拮抗。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R542.2
【部分图文】：
图１．小鼠心肌缺血再灌注损伤实验流程图??２．２．２具体实验步骤??第一阶段：建立胸腔闭合式小鼠缺血再灌注损伤预模型（图２）??（１）将小鼠放入麻醉诱导容器中，容器的一端连接异氟醚挥发灌装置，打开??挥发灌，将异氟醚的吸入溶度调至３．０?Ｖｏｌ％，氧流量调节至０．５?Ｌ／ｍｉｎ；??（２）待小鼠失去意识，并且触觉刺激反应和四肢撤退反射消失之后，将小鼠??转移到恒温控制的小动物外科手术台，予以平卧位，将口鼻部对准异氟醚吸入麻??醉剂圆锥形出口，以便继续维持小鼠一定的麻醉深度，并用一?５－０尼龙线通过固定??小鼠的上牙齿使其头部保持水平位置，以便于气管插管。??（３）从肛门插入肛温探头，维持小鼠体温在３７°Ｃ，用胶带固定小鼠四肢，将??小鼠的左下肢斜跨小鼠右上肢
图３．心肌缺血再灌注损伤实验操作及心电图表现??第三阶段：小鼠心肌缺血再灌注损伤结果评估??（１）小鼠心脏血菅恢复血供２?ｈ或２４?ｈ后，予以腹腔注射静脉麻醉剂，气管??插管接呼吸机通气；??（２）沿小鼠前正中线，剪开皮肤至剑突，打开腹腔，剪开膈肌，用缝线将前??胸壁向小鼠头端牵引并固定，充分暴露胸腔、心脏及周围组织；??（３）小心处理埋在皮下的８－０环状线圈，剪开线圈，将两端线头打结，结扎??ＬＡＤ；??（４）暴露左心房，用ｌｍｌ注射器向左心房缓慢注射１０％?ｐｈｔｈａｌｏ?ｂｌｕｅ，待心脏??组织慢慢变蓝后，再向左心房注射１０％氯化钾溶液，直至心脏停止跳动；??（５）小心切下整个小鼠心脏，放入装有ＰＢＳ的６０?ｍｍ的培养皿中，漂洗数次，??
士学位论文?第一部分从冰箱取出心脏，放入小鼠心脏切片装置（图４），将心脏组织，并将心脏薄片组织放入装有１．５％ＴＴＣ的９６孔板中，放入３７°ｉｎ；??将心脏薄片放入载薄片中，两端垫上１?ｍｍ厚的金属片后盖上下，观察心脏组织坏死情况，拍照保存，并用Ｉｍａｇｅ?Ｊ软件计算
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2848946
