miR-1a-3p改善异丙肾上腺素诱导的心力衰竭及其机制研究
发布时间：2020-10-31 07:46
研究背景:心力衰竭(heart failure,HF)是各种心血管疾病发展的终末阶段,对于心力衰竭的治疗目标不仅仅限于对症治疗,更重要的是阻断甚至逆转正常的心脏组织向不可逆病理组织学的转化,现在越来越多的研究表明心力衰竭的发生发展与某些基因的表达及功能发挥密切相关,基因治疗越来越成为一种治疗心力衰竭的新的前景,而微小RNA(miRNAs)已成为治疗心力衰竭的潜在靶标。miR-1是心脏组织中表达量最高且仅在心肌中表达的miRNA,已有研究表明miR-1可以在心力衰竭发展的适应阶段逆转心肌肥大,但是若心力衰竭已进展到适应不良阶段后,miR-1是否仍然可以逆转心脏功能障碍并改善心脏重塑是未知的。研究目的:1.成功建立心力衰竭小鼠模型,验证心力衰竭小鼠心脏组织中Dicer及miRNAs的差异表达。2.探索miR-1a-3p对心力衰竭小鼠是否有治疗作用。3.初步研究miR-1a-3p治疗心力衰竭小鼠的机制。研究方法:1.连续28天分别每天以异丙肾上腺素60mg/kg诱导小鼠发生心力衰竭,28天后对各组小鼠行超声心动图检测;取心脏组织观测心脏大体观,分别记录心脏重量、肺脏重量与体重的比值;石蜡切片行HE染色观察肌纤维排列及形态、天狼星红染色观察心肌纤维化、麦胚凝集素(WGA)染色观察细胞肥大,评估心脏重塑的情况;酶联免疫法(ELISA)测定血清NT-proBNP表达水平;确定连续28天每天腹腔注射异丙肾上腺素60mg/kg是否可以成功诱导小鼠心力衰竭。2.建立小鼠心力衰竭模型后,取心脏组织行蛋白质免疫印迹技术(Western blotting)检测Dicer蛋白的表达,行实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测衰竭心脏中miR-1a-3p、miR-133a-3p、miR-195a-5p,miR-208a-3p及miR-499-5p的表达。3.向发生心力衰竭的小鼠尾静脉注射miR-1a-3p agomir(agomir-1),qRT-PCR验证转染效率,治疗前后行超声心动图检测,ELISA测定各组小鼠血清NT-proBNP表达水平,评估miR-1a-3p能否改善心功能。4.取完整心脏组织观察大体形状,分别记录心脏重量、肺脏重量与体重的比值。5.石蜡切片行HE染色观察肌纤维排列及形态、天狼星红染色后分别在光镜下观察心肌纤维化和在偏振光显微镜下进行胶原纤维分型、WGA染色观察细胞肥大、TUNEL染色进行细胞凋亡检测、Ki67免疫荧光染色分析细胞增殖以及过碘酸雪夫氏染色(PAS)检测心脏组织糖原沉积情况,评估miR-1a-3p是否改善心脏重塑。6.采用Western blotting技术检测miR-1a-3p治疗后Dicer的表达情况;运用Western blotting及免疫组织化学染色技术检测miR-1a-3p的靶基因线粒体编码的NADH脱氢酶1(ND1)和线粒体编码的细胞色素c氧化酶I(COX1)的表达及线粒体Ca~(2+)单向转运蛋白(MCU)的表达情况;为了排除全球效应的影响运用Western blot技术检测线粒体基因COX2、COX3及ND5的表达,分析补偿性输入miR-1a-3p是否通过调控其靶基因ND1、COX1及MCU的表达改善异丙肾上腺素诱导的小鼠心力衰竭。研究结果:1.连续28天每天以60mg/kg的剂量腹腔注射异丙肾上腺素期间,小鼠出现毛发脱落、体重减轻、摄食下降及活动量减少等表现,28天后成功诱导小鼠心功能恶化及心脏重构,建立小鼠心力衰竭模型。2.衰竭的心脏组织中Dicer表达水平明显降低,其下游产物miR-1a-3p、miR-133a-3p表达明显下降,miR-195a-5p、miR-208a-3p及miR-499a-5p表达明显增高。3.向心衰的小鼠进行尾静脉注射agomir-1可恢复心脏中miR-1a-3p的表达。4.补偿性输入agomir-1可以减轻异丙肾上腺素诱导的小鼠心功能恶化:输入agomir-1后小鼠心脏左室射血分数(EF)及左室缩短分数(FS)明显增加,血清NT-proBNP水平明显降低但是仍然高于空白组。5.补偿性输入agomir-1明显改善异丙肾上腺素诱导的小鼠心脏重构:心脏大体观可见miR-1a-3p治疗组的小鼠心脏明显减小,心重体重比及肺重体重比明显降低;HE染色可见心肌细胞排列紊乱减轻、天狼星红染色光镜下显示间质纤维化明显减少、WGA染色可见细胞肥大减轻、TUNEL免疫荧光染色显示凋亡的细胞明显减少、Ki67免疫荧光染色可见细胞增殖减少及PAS染色提示心肌组织糖原沉积情况减轻;此外,天狼星红染色偏振光显微镜下可见治疗后Ⅰ型胶原纤维减少。6.补偿性输入agomir-1后并未改变Dicer的表达,但是明显增加其靶基因ND1及COX1的表达,而线粒体编码的COX2、COX3及ND5的表达较模型组相比并无明显改变。7.补偿性输入agomir-1后明显降低其靶基因MCU的表达。研究结论:1.每天连续以60mg/kg的剂量腹腔注射异丙肾上腺素可以成功诱导小鼠心力衰竭模型,并且衰竭的心脏组织中Dicer及其下游产物miR-1a-3p表达降低。2.补偿性输入agomir-1可以明显改善异丙肾上腺素诱导的心力衰竭。3.miR-1a-3p可能通过增加ND1和COX1的表达,减少MCU的表达改善心力衰竭。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R541.6
【部分图文】：
11 只小鼠存活。我们发现死亡的14 只小鼠的心脏有不同程度的增大。此外，所有存活的小鼠都出现食欲不振（图3.1 B）、体重减轻（图 3.1 D）、毛发脱落（图 3.1 C）和运动量减少等表现。图 3.1 异丙肾上腺素诱导期间小鼠出现的症状Figure 3.1 Symptoms of mice during isoproterenol induction
注射异丙肾上腺素的小鼠表现出左心室收缩功能受损（图3.2A）。具体而言，LVIDD 和 LVIDS 分别增加超过 17％和 46％（图 3.2 C-D）。此外，EF 和 FS 分别下降超过 23％和 33％（图 3.2 E-F）。再者，ISO 注射小鼠中NT-proBNP 水平的增加也表明心脏功能受损（图 3.2 B）。图 3.2 异丙肾上腺素诱导的小鼠出现严重心脏功能障碍Figure 3.2 Severe cardiac dysfunction in mice exposed to ISO.A: Representative raw tracings of M-mode echocardiography. B: NT-proBNP in serum by ELISA.*P < 0.05 vs CON, mean ± SEM, n = 3 for CON and 3 for ISO. C-F: Echocardiographicmeasurements of left ventricular internal diameters in diastole (LVIDD, mm) (C); left ventricularinternal diameters in systole (LVIDS, mm) (D); left ventricular ejection fraction (EF, %) (E); leftventricular fractional shortening (FS, %) (F). *P < 0.05, **P<0.01 vs CON; mean ± SEM, n = 3 forCON and 3 for ISO.在注射异丙肾上腺素 28 天后，小鼠心脏显著增大，并且它们的心脏重量与体重比和肺重量与体重比均增加 20％以上（图 3.3A-C）。组织学检查显示，心脏出现明显的心肌细胞排列紊乱（图 3.3 D）、严重的间质纤维化（图 3.3 E）和心肌细胞肥大（图 3.3 F）。
图 3.3 异丙肾上腺素诱导后小鼠心脏形态。Figure 3.3 Heart morphology in mice after exposure to ISO.ross anatomical features of the hearts. B: The ratio of heart weight to body weight. *P < 0N; mean ± SEM, n = 3 for CON and 3 for ISO. C: The ratio of lung weight to body weight vs CON; mean ± SEM, n = 3 for CON and 3 for ISO. D: HE staining of cross sections rts. E: Assessment of myocardial fibrosis by Sirius Red staining. Quantified fibrotic area. .0001; mean ± SEM, n = 3 for CON and 3 for ISO. F: Determination of cardiomyocyte ceGA staining analysis, cardiomyocyte cross-sectional area (m2) measurements. 衰竭的心脏组织中 Dicer、miR-1a-3p 和 miR-133a-3p 表达下降，并且 miR-195a-5p、miR-208a-3p 和 miR-499-5p 的表平升高。
【相似文献】
本文编号：2863657
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R541.6
【部分图文】：
11 只小鼠存活。我们发现死亡的14 只小鼠的心脏有不同程度的增大。此外，所有存活的小鼠都出现食欲不振（图3.1 B）、体重减轻（图 3.1 D）、毛发脱落（图 3.1 C）和运动量减少等表现。图 3.1 异丙肾上腺素诱导期间小鼠出现的症状Figure 3.1 Symptoms of mice during isoproterenol induction
注射异丙肾上腺素的小鼠表现出左心室收缩功能受损（图3.2A）。具体而言，LVIDD 和 LVIDS 分别增加超过 17％和 46％（图 3.2 C-D）。此外，EF 和 FS 分别下降超过 23％和 33％（图 3.2 E-F）。再者，ISO 注射小鼠中NT-proBNP 水平的增加也表明心脏功能受损（图 3.2 B）。图 3.2 异丙肾上腺素诱导的小鼠出现严重心脏功能障碍Figure 3.2 Severe cardiac dysfunction in mice exposed to ISO.A: Representative raw tracings of M-mode echocardiography. B: NT-proBNP in serum by ELISA.*P < 0.05 vs CON, mean ± SEM, n = 3 for CON and 3 for ISO. C-F: Echocardiographicmeasurements of left ventricular internal diameters in diastole (LVIDD, mm) (C); left ventricularinternal diameters in systole (LVIDS, mm) (D); left ventricular ejection fraction (EF, %) (E); leftventricular fractional shortening (FS, %) (F). *P < 0.05, **P<0.01 vs CON; mean ± SEM, n = 3 forCON and 3 for ISO.在注射异丙肾上腺素 28 天后，小鼠心脏显著增大，并且它们的心脏重量与体重比和肺重量与体重比均增加 20％以上（图 3.3A-C）。组织学检查显示，心脏出现明显的心肌细胞排列紊乱（图 3.3 D）、严重的间质纤维化（图 3.3 E）和心肌细胞肥大（图 3.3 F）。
图 3.3 异丙肾上腺素诱导后小鼠心脏形态。Figure 3.3 Heart morphology in mice after exposure to ISO.ross anatomical features of the hearts. B: The ratio of heart weight to body weight. *P < 0N; mean ± SEM, n = 3 for CON and 3 for ISO. C: The ratio of lung weight to body weight vs CON; mean ± SEM, n = 3 for CON and 3 for ISO. D: HE staining of cross sections rts. E: Assessment of myocardial fibrosis by Sirius Red staining. Quantified fibrotic area. .0001; mean ± SEM, n = 3 for CON and 3 for ISO. F: Determination of cardiomyocyte ceGA staining analysis, cardiomyocyte cross-sectional area (m2) measurements. 衰竭的心脏组织中 Dicer、miR-1a-3p 和 miR-133a-3p 表达下降，并且 miR-195a-5p、miR-208a-3p 和 miR-499-5p 的表平升高。
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1 何芮;miR-1a-3p改善异丙肾上腺素诱导的心力衰竭及其机制研究[D];重庆医科大学;2019年
本文编号：2863657
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