ZNF667通过mTOR抑制有氧糖酵解减轻LPS诱导的巨噬细胞炎症反应

发布时间：2020-10-31 15:09

　　 【目的】探讨锌指蛋白667(zinc finger protein 667,ZNF667)对脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导的Raw264.7巨噬细胞炎症反应的影响及其作用机制。【方法】(1)以Raw264.7巨噬细胞系为研究对象,采用LPS诱导建立炎症巨噬细胞模型,蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)检测细胞ZNF667蛋白表达水平的变化;(2)采用脂质体介导的质粒瞬时转染技术建立ZNF667过表达巨噬细胞,通过WB、逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测LPS刺激后诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、白介素(interlukin,IL)-1β表达水平的变化,酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测LPS刺激后细胞上清液炎性细胞因子IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的水平;(3)采用脂质体介导的质粒瞬时转染技术建立过表达ZNF667或抑制ZNF667表达巨噬细胞,通过WB检测LPS诱导的巨噬细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路蛋白表达及磷酸化水平的变化;(4)采用双荧光素酶报告基因和WB分别检测过表达ZNF667对LPS诱导的巨噬细胞核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)转录活性及NF-κB p65、p38促分裂素原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinases,p38 MAPK)、细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extracellular signal regulated kinase 1/2,ERK1/2)表达及磷酸化水平的影响;(5)采用RT-PCR和WB法分别检测过表达ZNF667或抑制ZNF667表达对LPS诱导的巨噬细胞糖酵解关键酶己糖激酶2(hexokinase 2,HK2)、6磷酸果糖2激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3,PFKFB3)表达水平的影响,并采用化学比色法检测细胞上清液中葡萄糖消耗率及乳酸生成的变化;(6)采用RT-PCR检测己糖激酶抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖(2-Deoxy-D-Glucose,2-DG)对LPS诱导的低表达ZNF667巨噬细胞炎性细胞因子IL-1β、iNOS表达水平的影响;(7)采用RT-PCR检测mTOR抑制剂Rapamycin(RPM)对LPS诱导的过表达ZNF667或抑制ZNF667表达巨噬细胞中HK2、PFKFB3 mRNA表达水平的影响,并采用化学比色法检测细胞上清液中葡萄糖消耗率及乳酸生成的变化。【结果】(1)采用浓度分别为50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml LPS处理细胞12h后,ZNF667蛋白表达上调且以100 ng/ml处理组变化最为显著;采用100 ng/ml LPS分别处理细胞6h、12h、24h、48h后,ZNF667蛋白表达上调且以12h处理组变化最为显著;(2)过表达ZNF667能够显著下调LPS诱导的巨噬细胞炎性因子IL-1β、iNOS的mRNA和蛋白表达,并抑制细胞IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌;(3)过表达ZNF667能够抑制LPS诱导的巨噬细胞PI3K、AKT、mTOR蛋白磷酸化水平上调;(4)过表达ZNF667对LPS诱导的巨噬细胞NF-κB转录因子活性及p65、p38 MAPK、ERK1/2的磷酸化水平未见明显影响;(5)过表达ZNF667能够明显抑制LPS诱导的巨噬细胞糖酵解关键酶HK2、PFKFB3 mRNA的表达上调和细胞对葡糖糖的摄取及乳酸生成;(6)抑制ZNF667表达增强了LPS对巨噬细胞HK2、PFKFB3 mRNA表达水平的上调作用,而糖酵解抑制剂2-DG能够阻断此作用;(7)mTOR抑制剂RPM能够阻断ZNF667对LPS诱导的巨噬细胞糖酵解关键酶HK2、PFKFB3 mRNA表达上调、葡萄糖消耗增加及乳酸生成增多的调节作用。【结论】ZNF667通过mTOR调节有氧糖酵解抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应。
【学位单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R54
【部分图文】：

第 3 章 实验结果第 3 章 实验结果7 在 LPS 诱导的巨噬细胞炎症反应中的表达变度 LPS 对 Raw264.7 巨噬细胞 ZNF667 蛋白表达不同浓度的 LPS 处理 Raw264.7 细胞 12h 建立巨噬细胞炎实验检测 ZNF667 蛋白的表达水平。结果显示，在 L表达增加，且随着 LPS 浓度逐渐增高呈现先上调后回落的浓度在 100ng/ml 时，ZNF667 蛋白表达上调最为显著，<0.01，图 1）。

2 LPS 处理不同时间对 Raw264.7 巨噬细胞 ZNF667 蛋白表（*P <0.05，**P <0.01 vs 0h LPS group，n=3）达 ZNF667 巨噬细胞的建立质体介导的质粒瞬时转染技术建立 ZNF667 过表达 Raw2印迹实验检测细胞 ZNF667 蛋白的表达水平。结果发ZNF667 质粒后，Raw264.7 巨噬细胞 ZNF667 蛋白的表达空载体细胞组比较，ZNF667 蛋白的表达水平提高了约 14

图 2 LPS 处理不同时间对 Raw264.7 巨噬细胞 ZNF667 蛋白表达（*P <0.05，**P <0.01 vs 0h LPS group，n=3）表达 ZNF667 巨噬细胞的建立用脂质体介导的质粒瞬时转染技术建立 ZNF667 过表达 Raw264.疫印迹实验检测细胞 ZNF667 蛋白的表达水平。结果发现3.1-ZNF667 质粒后，Raw264.7 巨噬细胞 ZNF667 蛋白的表达水平染空载体细胞组比较，ZNF667 蛋白的表达水平提高了约 14 倍（
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本文编号：2864114