NK细胞在重型再生障碍性贫血免疫发病机制中的作用研究

发布时间：2020-11-06 02:01

　　 目的通过研究再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)小鼠模型自然杀伤细胞(nature killer cell,NK)数量、功能,明确NK细胞在AA发病机制中的作用及地位,同时通过分析不同免疫抑制及促造血治疗方案对AA小鼠模型NK细胞及其下游免疫环节的影响,为AA开展新治疗提供理论依据。进一步通过筛选重型再生障碍性贫血(Severe aplastic anemia,SAA)患者NK细胞的差异蛋白表达,探讨NK细胞在AA中发挥免疫调节作用的机制。方法第一部分:构建AA小鼠模型,造模第17天收获小鼠,测血常规,分离右侧股骨做骨髓病理;采用流式细胞术(FCM)、PCR、ELISA等方法检测小鼠外周血NK细胞数量、亚群、功能,髓系树突状细胞(myeloid dendritic cell,mDC)数量及表面协同分子表达,CD8~+T细胞数量、功能,调节性T细胞(Tregs)数量及功能,血浆IFN-γ、IL-4水平。提取同源正常小鼠NK细胞回输至AA小鼠体内,观察小鼠症状、体征及免疫指标的变化。第二部分:构建AA小鼠模型,分别给予环孢菌素A(CsA)、艾曲波帕(Elt)、CsA联合Elt、雷帕霉素(RPM)进行药物干预,观察小鼠体重、血象、骨髓细胞计数、骨髓病理、生存期变化,采用FCM等方法检测小鼠NK细胞数量、亚群、功能变化,mDC数量及表面协同分子表达变化,CD8~+T细胞数量、功能变化,Tregs数量及功能变化,血浆IFN-γ、IL-4水平变化。第三部分:分选SAA患者及正常对照外周血NK细胞,提取总蛋白,分为SAA组、正常组,标记肽段,进行质谱检测,每组重复两次。采用PD软件(Proteome Discoverer 1.4)筛选,SEQUEST HT搜素,搜索结果与筛选后的谱图进行定量分析。ANOVA方差分析评估结果差异性,选取p0.05,ratio≥1.2或ratio≤0.83的蛋白为差异蛋白。结果第一部分:成功构建AA小鼠模型,AA组小鼠体重、血象、骨髓细胞计数均明显低于正常组(NC组)。应用FCM、PCR、ELISA检测AA小鼠及正常小鼠细胞免疫状态。结果显示,AA组与NC组相比,CD8~+T细胞比例(52.23±6.45%vs 37.67±7.95%)、穿孔素(perforin)mRNA相对表达水平(1.78±0.15 vs1.15±0.22)、颗粒酶(GB)mRNA相对表达水平(1.81±0.16 vs 1.08±0.15)、mDC表面CD86表达水平(9.15±2.85%vs 6.18±2.10%)、CD80表达水平(18.09±3.39%vs 14.62±3.61%)均明显升高,Tregs比例(4.80±2.07%vs 6.70±2.43%)、Tregs表面CTLA-4表达水平(15.13±4.80%vs 19.26±4.66%)均明显下降,差别均有统计学意义(p0.05)。AA小鼠NK细胞比例(0.59±0.37%vs 3.38±0.49%)、调节性NK细胞比例(2.79±2.54%vs 24.57±4.56%)较NC组明显下降,功能性NK细胞比例(77.93±11.45%vs 49.92±6.48%)、调节性NK细胞表面NKG2D表达水平(87.14±6.26%vs 76.89±10.02%)、功能性NK细胞表面NKG2D表达水平(77.50±11.10%vs 67.03±8.22%)均较NC组明显上升,差别均有统计学意义(p0.05)。AA小鼠NK数量减少、调节性NK细胞比例降低与疾病严重程度存在一定相关性。NK细胞回输后,NK细胞回输组(NK组)小鼠NK细胞比例(12.61±3.10%vs 0.89±0.54%)、调节性NK细胞比例(26.14±4.98%vs1.66±1.68%)明显高于AA组,差别均有统计学意义(p0.05)。NK组小鼠Hb(83.50±7.88g/L vs 71.50±7.96 g/L)、RBC(5.17±0.97×10~(12)/L vs 4.08±0.83×10~(12)/L)、PLT(128.50±40.72×10~9/L vs 76.00±30.59×10~9/L)、骨髓细胞计数(6.92±1.10×10~7/L×10~7/L vs 3.92±0.89)、生存期(52.5天vs 25天)较AA组明显上升,差别均有统计学意义(p0.05)。NK组较AA组小鼠CD8~+T细胞、CD8~+T细胞内perforin表达、CD8~+T细胞内GB表达、mDC数量、mDC表面CD80与CD86的表达均下降,差别有统计学意义(p0.05),而Tregs数量及其CTLA-4表达水平无明显变化(p0.05)。第二部分:AA小鼠体重、血象、骨髓细胞计数均明显低于NC组,细胞免疫状态明显高于NC组。与AA组小鼠比较,(1)CsA治疗组血象(Hb:89.40±11.61g/L vs 76.30±11.00 g/L;RBC:3.61±0.62×10~(12)/L vs 2.94±0.57×10~(12)/L;PLT:232.10±65.22×10~9/L vs 91.30±38.52×10~9/L)及骨髓衰竭状态(3.67±0.62×10~7/L vs 2.44±0.77×10~7/L)改善,小鼠90天生存率提高(40%),CD8~+T数量减少(49.05±7.47%vs 68.12±5.81%),胞内perforin(7.88±2.46%vs 10.53±2.06%)及GB(51.14±8.86%vs 68.71±7.96%)表达下降,mDC表面CD80(15.11±2.85%vs18.54±2.73%)表达下降,Tregs细胞表面CTLA-4(15.34±3.97%vs 12.63±2.68%)表达升高,调节性NK比例上升(12.14±3.44%vs 3.25±1.91%),差异有统计学意义(p0.05)。(2)Elt组小鼠Hb(82.60±10.25 g/L)及RBC(3.62±0.44×10~(12)/L)升高,但骨髓细胞计数、生存期及细胞免疫状态较AA小鼠均无明显改善。(3)CsA+Elt组小鼠Hb(99.50±9.13g/L)、RBC(4.11±0.59×10~(12)/L)、PLT(243.70±56.35×10~9/L)、骨髓细胞计数(4.12±0.76×10~7/L)均明显升高,90天生存率提高(80%),调节性NK细胞数量增加(11.20±3.41%),CD8+T细胞及mDC明显受抑,Tregs数量(6.13±1.72%)及表面CTLA-4表达(16.47±2.59%)均升高(p0.05)。(4)RPM组小鼠治疗后血象(RBC:3.81±0.24×10~(12)/L,Hb:93.70±10.45 g/L,PLT:255.50±53.10×10~9/L)、骨髓细胞计数(3.85±0.76×10~7/L)、90天生存率(80%)明显上升(p0.05);功能性NK细胞表面NKG2D表达(68.70±5.50%)下降;其CD8~+T细胞数量(50.83±8.28%)、Perforin(6.35±2.49%)及GB(45.92±8.54%)表达均下降(p0.05);而Tregs数量(6.84±1.83%)及表面CTLA-4表达水平(17.48±2.43%)明显升高(p0.05)。第三部分:与正常对照相比,SAA患者NK细胞93组蛋白表达水平存在明显差异,其中上调蛋白48组,包括组蛋白H1.2、组蛋白H1.3、干扰素调节因子1(IRF-1)等;下调蛋白45组,包括肌动蛋白相关复合体(ARP2/3),组蛋白H3、组蛋白H4、Protein S100 A8、Protein S100 A9等。结论(1)与对照组小鼠相比,AA小鼠模型中NK细胞数量减少,调节性NK细胞比例降低,NK细胞表面NKG2D表达升高。NK细胞回输后,AA小鼠NK细胞缺乏的状态改善,调节性NK细胞比例恢复,细胞免疫的亢进状态受到抑制,改善了AA小鼠病情。提示NK细胞可能在AA发病中发挥保护性作用。(2)CsA、艾曲波帕、雷帕霉素均可改善AA小鼠模型造血功能,对AA小鼠模型治疗有效。CsA联合艾曲波帕治疗效果最佳,提示二者可能存在协同作用。CsA可以明显升高AA小鼠NK细胞数量及调节性NK细胞比例,对NK细胞功能存在明显影响。雷帕霉素对AA小鼠Tregs有明显扩增作用,并可以改善其功能。CsA、雷帕霉素均可抑制AA小鼠亢进的细胞免疫状态,从而改善小鼠病情,但作用机制可能存在差异。(3)通过蛋白质组学分析发现,SAA患者NK细胞在细胞组分、生物学过程、分子功能方面与正常对照组均存在明显差异。SAA患者NK细胞的胞吞作用、FC-γ受体介导的吞噬作用相关蛋白明显下调。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R556.5
【部分图文】：

图 1.1 小鼠 CD8+T 细胞分选纯度图，分选后 CD8+T 细胞比例为 95%以上A:：设门图；B：分选后剩余细胞；C：分选得到的 CD8+T 细胞（3）提取总 RNA①取分选后的细胞至离心管中，加入 1 mLTrizol ，吹打混匀，室温下放置15 分钟。②加入氯仿 200μ1，剧烈震荡混匀至粉色乳糜状，室温静置 2-3min，4°C 离心， 12000rpm，15min。③自离心管内轻吸出水相上层，转移至新 EP 管中，不可接触下层蛋白质层。随后加入预冷至 4°C 的异丙醇 600ul，震荡混匀。在-20°C 环境中静置 2 小时或过夜后， 4°C 离心，12000rpm，15min，弃去上清。④向下层沉淀中加入预冷的-20°C 无水 1ml，轻弹混匀， 4°C 离心，12000rpm，5min，弃上清，重复 1 次。⑤通风干燥处静置 10min，使乙醇充分挥发，干燥 RNA。⑦加 RNase-free ddH2O 12μl，充分溶解 RNA，分光光度计测定 RNA 纯度。

用中位数表示，采用秩和检验；构成earman’s rank correlation test 分析；绘制 on 法比较小鼠生存曲线是否有差异；p<0一般情况、血象、骨髓计数分为正常对照组（NC 组），单纯照射组较三组小鼠一般情况、血常规、骨髓计数情况 组小鼠造模第 17 天时体重为（22.00±1重为（21.18±1.83）g，AA 组小鼠造模三组之间差异有显著性（p<0.01）。AA 组异有统计学意义（p<0.05），NC 组与 TB.2）。

×109/L；AA 组小鼠造模第 17 天时 WBC 为（9）×1012/L， Hb 为（69.00±14.34）g/L， PLOVA 方差分析，三组小鼠 WBC、RBC、Hb1）。分别两两比较显示，TBI 组与 NC 组相有统计学意义（p<0.05），RBC 及 Hb 水平无明RBC、Hb、PLT 较 NC 组及 TBI 组均明显（表 1.1，图 1.3）。I 组、AA 组小鼠造模第 17 天血常规检测数BC（×109/L） RBC（×1012/L） Hb（g/L）4.69±0.76 9.07±1.25 153.80±6.492.74±0.74*8.05±0.75 144.40±8.94.55±0.36*#4.18±1.39*#69.00±14.34*组比较差异有显著性（p<0.05）；#表示和 T
【参考文献】

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本文编号：2872504