Kallistatin调节动脉粥样硬化炎症及构建靶向巨噬细胞黑色素纳米探针的研究

发布时间：2020-11-09 05:42

　　 第一部分Kallistatin抗动脉粥样硬化炎症及机制研究目的:探讨组织激肽释放酶结合蛋白(kallistatin,KS)抑制动脉粥样硬化炎症的作用及其可能的机制。方法:利用颈总动脉分支结扎(PLCA)+高脂饮食的方法建立ApoE~(-/-)小鼠颈动脉粥样硬化模型。分别用腺病毒介导人KS cDNA(Ad.HKS)和空载腺病毒(Ad.Null)转染小鼠,术后14天和28天经核磁共振成像(MRI)检测动脉粥样硬化斑块进展,利用免疫组化、实时定量PCR检测斑块内炎症巨噬细胞M1/M2分型。进一步利用人KS蛋白(HKS)干预RAW264.7巨噬细胞,Real-time PCR检测M1/M2分型;使用Krüppel样因子4(KLF4)小干扰RNA(siRNA)阻断其信号通路。Western blot、流式细胞分析检测KLF4对HKS调节M1/M2分型的作用。结果:Ad.HKS转染后小鼠体内可高表达人KS蛋白。MRI及免疫组化显示KS抑制动脉粥样硬化斑块的形成且抑制炎症细胞聚集。免疫荧光及PCR显示M1巨噬细胞标志物一氧化氮合酶(iNOS)和单核细胞趋化蛋白(MCP-1)表达下降,M2巨噬细胞标志物精氨酸酶1(Arg1)和白细胞介素10(IL-10)表达升高。RAW264.7巨噬细胞的研究显示,KLF4 siRNA可阻断KS对M1/M2巨噬细胞分化调节作用。结论:KS可通过KLF4调节M1/M2巨噬细胞的分化,抑制炎症反应从而抑制动脉粥样硬化斑块的形成。第二部分黑色素纳米显像剂89Zr-RGD-MNP的构建及对动脉粥样硬化的活体成像研究目的:设计合成一种以黑色素纳米颗粒为载体,可靶向至动脉粥样硬化αⅴβ3的正电子发射计算机断层显像(PET)显像剂89Zr-RGD-MNP,并应用于动脉粥样硬化活体成像检测其效果。方法:以超小型水溶性黑色素纳米颗粒(MNP)为载体,共轭连接环状c(RGDf C)蛋白,鳌合放射性核素89Zr制备靶向动脉粥样硬化巨噬细胞受体αⅴβ3的黑色素显像剂。通过透射电镜(TEM)、动态光散射(DLS)检测其基本形态、结构和平均水合粒径,MTT法检测其细胞毒性,Fontana-Masson银染色检测其对巨噬细胞的靶向性。动脉分支结扎法建立动脉粥样硬化小鼠模型,尾静脉注射显像剂,不同时间点PET成像检测其成像效果,成像后利用γ放射性检测仪检测显像剂在各组织分布情况。结果:制备出黑色素纳米探针89Zr-RGD-MNP。TEM检测显示其形态规则、DLS平均水合粒径10 nm且分布均匀。MTT法显示其对细胞活性无明显影响,Fotana-Masson银染色显示对巨噬细胞靶向性高。PET成像显示显像剂可在动脉粥样硬化部位高度聚集,并可被特异性阻断剂阻断。体内放射性分布显示动脉粥样硬化血管放射性(5.29%±0.78%)明显高于空白对照血管(2.11%±1.55%)。结论:成功制备出性能稳定,粒径较小、分散性好、生物安全性高的黑色素显像剂。能够成功用于动脉粥样硬化的活体PET显像,有望成为一种新型的检测动脉粥样硬化的显像剂。
【学位单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R543.5
【部分图文】：

图 1.1 颈动脉分支结扎建立动脉粥样硬化模型的方法。6）术后清理手术创面，缝合皮肤。待动物苏醒后置于 SPF 级动物房内，20~25℃，灯光开闭各 12 h，继续予高脂饮食。2.2 7.0 T 核磁共振成像采用德国 Bruker7.0TMicro-MR 成像系统，在小鼠术后 14d 及 28d 进行核磁共振扫描。1）用 3-4%浓度异氟烷诱导麻醉小鼠，仰卧位放置于专用扫描床内，异氟烷以 1-2% 浓度 0.3-0.5L/min 流量持续麻醉，呼吸监测调整呼吸频率在 40 次/分左右以确保像图像质量。2）MR 定位像扫描，使小鼠颈部置于磁场中心，为确保不同扫描时间点 MR图像可以匹配，扫描时以主动脉弓为起点。采用 T2 及 PD 加权成像序列，具体参数如下：PD-T2：TR 1206.9 ms, TE 12.8/34.2 ms, FOV 2.5 × 2.5 cm, FA 180°,矩阵

图 1.3 实时定量 PCR 检测 28 天时 ApoA1mRNA 的转录水平。A. 血管组织，B. 肝脏组织。*P＜0.05,Ad. HKS vsAd. Null。3.3 HKS 抑制动脉粥样硬化斑块进展动物分别在建模后14天、28天行MRI检测。MRI采用德国Bruker 7.0 TMicro-MR成像系统，T2-PD双回波序列。如图1.4所示，正常对照侧血管在T2WI上呈低信号，在PDWI上呈等信号，术侧血管在T2WI和PDWI信号均增强。在14天时，可见动脉内膜增厚，管腔狭窄；28天时，管腔狭窄可见明显加重。Ad. HKS组管腔直径（14天 0.44 ± 0.04 mm，28天 0.34 ± 0.07 mm）和斑块体积（14天0.35 ±0.06 mm3，28天0.59 ±0.15 mm3）明显小于Ad. Null组（血管直径14天 0.44 ± 0.04 mm，28天 0.34 ± 0.07 mm 和斑块体积 14天0.35 ±0.06mm3，28天0.59 ±0.15 mm3）。

52图 1.4 Ad. Null 和 Ad. HKS 组术后 14 天及 28 天的颈部血管动脉粥样硬化进展情况的 MRI图像。MSME-PD 为质子加权像，MSME-T2 为 T2 加权像。A. 术后 14 天显示，两组图像上均有左侧（手术侧）血管管腔 PD 及 T2 信号增高，管壁增厚，较对侧狭窄，但 Ad. HKS 组管壁厚度明显小于 Ad. Null 组。B. 术后 28 天显示，两组左侧血管管壁厚度均增加， Ad.HKS 组管壁厚度仍然小于 Ad.Null 组。 C. 两组左侧血管管腔直径的比较。D. 两组斑块体积的比较。mean 士 SD *P < 0.05,Ad. HKS vsAd. Null。3.4 HKS 抑制颈动脉斑块炎症血管HE染色显示管腔狭窄与MRI结果相符合。CD68染色显示Ad. HKS组14天时CD68阳性细胞占5.88 ± 3.20%，28天时占16.89 ±9.12%；Ad. Null组14天时CD68阳性细胞占22.76 ±5.72%，28天时占32.30 ±8.11% (n = 10, P < 0.05，图1.5)。结果表明Ad. HKS组的斑块内巨噬细胞明显少于Ad. Nul组。肝脏CD68染色显示Ad. HKS组14天时CD68阳性细胞占2.79 ±1.12%斑块面积，28天时占4.32 ±1.32%；Ad. Null组14天时CD68阳性细胞占8.23 ±3.72%，28
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本文编号：2875977