CS离子浸提液修复小鼠心肌梗死的实验研究

发布时间：2020-11-11 07:03

　　 背景:促血管生成、重建血运,可减少心肌细胞凋亡和坏死,是治疗心肌梗死(MI)的关键。尽管临床上有诸多治疗方案,但基本都不能改善预后;基于细胞或非细胞的组织工程策略虽已取得一定进展,但都未过渡到临床使用阶段。此外,移植细胞归巢率低、滞留率低、存活率差以及生物材料植入和降解困难等问题限制了其应用,MI后心力衰竭的死亡率持续攀升。硅酸钙(CS)因其显著促血管生成效果被广泛用于硬组织工程,其主要通过离子溶解产物(特别是硅离子)发挥作用,但其在软组织缺血相关疾病如MI中的应用鲜有探讨。目的:探讨CS离子浸提液对小鼠心肌梗死的修复作用及机制。方法与结果:1.制备CS粉末及不同浓度离子浸提液,采用ICP-OES分析各离子的浓度;常氧和糖氧剥夺条件下,CCK-8检测不同浓度的CS浸提液对心肌细胞活力的影响;静脉注射CS浸提液,探讨CS在体内的分布、代谢以及安全性。选取1/64CS作为后续细胞实验的干预浓度并初步证实CS静脉注射在体内是安全的。2.建立急性心肌梗死模型,采用CS原液(200μ1/隔天)静脉注射干预14天,对比治疗前后心脏超声水平;Masson染色、Tunel免疫组织化学染色、vWF、Isolectin-GS IB4以及Cx43免疫荧光染色、血清NT-proBNP、HW/BW评估CS对心肌纤维化、心肌肥大以及新生血管形成等影响。结果提示,CS浸提液能改善急性心肌梗死后小鼠心功能,抑制心肌细胞凋亡,促进新生血管形成。3.体外建立糖氧剥夺的细胞模型,构建大鼠原代心肌细胞和人脐静脉内皮细胞共培养体系。Tunel染色检测心肌细胞凋亡情况;RT-qPCR检测VEGF、KDR、Cx43基因表达情况;Western blot检测c-caspase-3、Cx43以及MAPKs家族蛋白表达情况;Cx43、vWF免疫荧光检测新生血管形成情况。结果提示,1/64CS能促进共培养体系内皮细胞新生血管的形成,促进VEGF和KDR的表达;抑制糖氧剥夺诱导的心肌细胞凋亡,抑制c-caspase-3蛋白的表达,调节Cx43和MAPKs家族蛋白的表达。结论:CS浸提液能改善心肌梗死后小鼠心功能,其可能通过促进细胞间交流,上调Cx43表达,促进VEGF介导的新生血管的形成;调节MAPKs家族蛋白表达,抑制心肌细胞凋亡等途径发挥作用。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R542.22
【部分图文】：

３．２常氧和糖氧剥夺条件下，不同浓度ＣＳ浸提液对原代心肌细胞活力的影响。??首先，为了鉴定分离得到的原代心肌细胞纯度，我们采用了对心肌细胞特??异性蛋白ｃＴｎＴ和成纤维细胞特异性蛋白ｖｉｍｅｎｔｉｎ进行免疫荧光染色。从图１－１??可以看出，采用差速贴壁法分离，得到的心肌细胞悬液中，成纤维细胞的数量??２０??

Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ?Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ??图１－１分离得到的原代心肌细胞纯度分析??Ｆｉｇ．?１－１?Ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ?ｏｆＮＲＣＭｓ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｉｓｏｌａｔｅｄ?ｐｒｉｍａｒｙ?ｃｅｌｌｓ??（ａ）?ｃＴｎＴ?（色，心肌细胞特异性标记）绿和ｖｉｍｅｎｔｉｎ?（红色，成纤维细胞特异性标记）免疫荧??光染色。（ｂ）统计分析分离得到的细胞中ＮＲＣＭｓ所占的比例（ｎ＝５）．??为了评估Ｓｉ离子的保护作用，我们检测了正常条件和糖氧剥夺环境下ＣＳ??浸提液对ＮＲＣＭｓ的细胞活力的影响。正常条件下处理５天后，１／８，?１／１６，?１／３２??和１／６４?ＣＳ?（ＤＭＥＭ）能显著改善心肌细胞的活力，但ＣＳ原液对心肌细胞活力??没有影响，提示在正常条件下，一定浓度范围的Ｓｉ离子对心肌细胞具有保护作??用（图ｌ－２ａ）。从图ｌ－２ｂ可以发现，糖氧剥夺的ＰＢＳ培养基中，ＮＲＣＭｓ的活力??显著下降。而１／８，?１／１６，?１／３２和１／６４?ＣＳ能改善糖氧剥夺环境下心肌细胞活力，??其中１／３２和１／６４ＣＳ其保护作用最明显。这些结果提示

??基因的表达情况。从图１－３可以看出，正常条件下，相比ｃｏｎｔｒｏｌ组，１／６４ＣＳ培??养组心肌细胞内ｃＴｎＴ和Ｍｙｈ６基因表达情况均显著上升。然而，在糖氧剥夺条??件下，只有ｃＴｎＴ基因表达上升，Ｍｙｈ６却未见显著差异。??ａ?ｂ??｜?ｃｏｎｔｒｏｌ?■?ｃｏｎｔｒｏｌ??２?５１?＊＊?■１／６４ＣＳ?２．５－１?｜１／６４ＣＳ??Ｘ１２．〇．?＾?１．１２．０－?工??１１１＇５＇?Ｉ?ｉ?ＩＩ１＇５－?Ｔ?ｉ??ｑ：：ｉｌｌ?８１?５｜：：１ｉＬｕ＿??ｎｏｒｍｏｘｉａ?ｈｙｐｏｘｉａ?ｎｏｒｍｏｘｉａ?ｈｙｐｏｘｉａ??图１－３正常或糖氧剥夺条件下，１／６４ＣＳ浸提液对大鼠原代心肌细胞内心肌特异性标记ｃＴｎＴ??以及Ｍｙｈ６基因表达情况的影响??Ｆｉｇ．?１－３?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ｓｉｌｉｃｏｎ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ?ｉｏｎ?ｅｘｔｒａｃｔｓ?ｏｎ?ｔｈｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ?ｓｐｅｃｉｆｉｃ?ｍａｒｋｅｒ??ｇｅｎｅｓ?ｕｎｄｅｒ?ｎｏｒｍｏｘｉａ?ａｎｄ?ｇｌｕｃｏｓｅ／ｏｘｙｇｅｎ?ｄｅｐｒｉｖｅｄ?ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ?ｉｎ?ｖｉｔｒｏ??⑷正常（培养５天）或糖氧剥夺（处理１２０分钟）条件下，原代心肌细胞内心肌特异性标??记ｃＴｎＴ基因表达情况。（ｂ）正常（培养５天）或糖氧剥夺（处理１２０分钟）条件下，原代心??肌细胞心肌特异性标记Ｍｙｈ６基因表达情况。＊ｐ＜０．０５，?＊＊ｐ＜０．０１ｒａ．ｃｏｎｔｒｏｌ组．??３．４?ＣＳ浸提液静脉注射后Ｓｉ４＋在体内的分布、代谢及安全性??在体外的细胞实验中
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本文编号：2878897