叶酸多肽水凝胶联合诱导多能干细胞移植治疗小鼠心肌梗死的作用及机制研究

发布时间：2020-11-16 08:30

　　 背景:诱导多能干细胞(iPS)是一种极具应用前景的多能干细胞,和胚胎干细胞相似,能够在体内外分化成各种成体细胞,是一种理想的治疗心肌梗死的种子细胞,然而在缺血心肌组织中低下的存活率却限制了其应用。因此,我们合成出一种全新的可注射的基于叶酸的小分子水凝胶,并包裹iPS细胞进行移植治疗心肌梗死。目的:叶酸多肽水凝胶包裹iPS治疗心肌梗死并其评价效果,探讨叶酸多肽水凝胶作为可注射支架材料的可能,为iPS临床进一步应用提供实验依据。方法和结果:1.使用固相合成法合成了基于叶酸的多肽分子FA-FFFRGDssEE,并检测了其成胶性能。使用流变仪检测其形成水凝胶的流变性质,透射电镜观察其微观形貌;活-死细胞染色及CCK-8法检测其生物相容性;心肌组织注射检测水凝胶的体内降解性。结果显示,FA-FFFRGDssEE可以形成性能良好的水凝胶,并具备良好的生物相容性。2.以不依赖饲养层的方法培养iPS细胞,并以EB(拟胚体)法诱导iPS向心肌细胞分化。以qPCR方法检测分化第0,3,5,7,11,15天OCT3/4,MESP1,ISL-1,GATA4,MYH6,cTnT,vWF基因的表达变化。结果显示,细胞的多能性标志物,中胚层标志物,祖细胞标志物,心肌细胞及内皮细胞标志物的表达均随时间规律变化,符合胚胎发育的进程。分化的细胞中可以看到MYH6/cTnT和vWF染色阳性的细胞。随后用CCK-8检测了 iPS细胞在叶酸水凝胶(1.0 wt%,0.75 wt%,0.5 wt%)中的增殖,用活-死细胞染色观察了 iPS细胞在水凝胶中的存活。结果显示:iPS细胞在各个浓度叶酸水凝胶中的增殖和存活良好,无明显差别。我们选取了力学强度最高的叶酸水凝胶(1.0wt%)进行后续实验。以qPCR和免疫荧光检测了 iPS在l.Owt%叶酸水凝胶上的分化,结果显示:iPS能在1.0Wt%叶酸水凝胶上正常分化为心肌细胞和内皮细胞。我们又用流式细胞计数检测了氧化应激条件下,iPS在叶酸水凝胶中的凋亡情况。结果显示:叶酸水凝胶明显降低了 iPS在氧化应激中的凋亡率。3.叶酸多肽水凝胶包裹iPS对小鼠心肌梗死进行了移植治疗,实验分为5组:Sham 组,PBS 组,FAhydrogel 组,iPS 组,FAhydrogel+iPS 组。心梗后 28 天行心脏超声示:FA hydrogel+iPS组的心功能改善最明显。Masson染色示:FA hydrogel +iPS组心脏纤维化程度最小。免疫荧光示:FA hydrogel +iPS组的iPS细胞存活率更高。MYH6荧光染色示:iPS在小鼠心脏内继续分化为心肌细胞。vWF荧光染色示:FA hydrogel +iPS组梗死区的血管密度更高。Isolectin B4染色示:FAhydrogel+iPS组梗死周边区毛细血管密度更高。WGA染色示:FA hydrogel +iPS组心梗周边区心肌细胞肥大程度最小。心梗区和周边区组织qPCR结果示:FA hydrogel +iPS组VEGF和bFGF基因上调最多。结论:1.成功合成了基于叶酸的多肽分子FA-FFFRGDssEE,该多肽能自组装形成稳定透明的水凝胶,具有良好的生物相容性,体内可降解,具备作为心肌组织工程可注射支架材料的条件。2.成功以iPS诱导分化出心肌细胞和内皮细胞,且叶酸多肽水凝胶能够很好地容纳iPS的增殖,存活及分化,并能提高iPS细胞抗氧化损伤的能力。3.叶酸水凝胶联合iPS移植有效改善了心梗小鼠的心功能,抑制了心室重构,增加了 iPS的滞留率,促进新生血管形成。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R542.22
【部分图文】：

?第一部分叶酸多肽水凝胶的构建与性能评价???—ｘ?ｘ?ａ：?ａ：?ａｃ?ａｔ?２?ａｔ?？－?ｆ?－?？－?ｒ－?ｒ－?＾?ｒ－?＾?ｖ?－?？?＊?？?＊?＃?＾?￣?－?？？＇？：ｒ，?ｒ－．?ｒ，?－．?ｒ．?－?．?／？?－ｉ?——?——???????，

１．０ｗｔ％Ｂ）０．７５ｗｔ％Ｃ）０．５ｗｔ％，频率参数为?２ｒａｄ／ｓ，应力参数为?１％??Ｆｉｇｕｒｅ．?１－４?Ｒｈｅｏｌｏｇｉｃａｌ?ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ?ｗｉｔｈ?ｔｈｅ?ｍｏｄｅ?ｏｆ?ｄｙｎａｍｉｃ?ｔｉｍｅ?ｓｗｅｅｐ?ａｔ?ｔｈｅ?ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ?ｏｆ?２??ｒａｄ／ｓ?ａｎｄ?ｓｔｒａｉｎ?ｏｆ?１％?ｆｏｒ?ｔｈｅ?ｇｅｌｓ?ｏｆ?Ａ）?１．０?ｗｔ％，?Ｂ）?０．７５?ｗｔ％?ａｎｄ?Ｃ）?０．５?ｗｔ％?ｏｆ??ＦＡ－ＦＦＦＲＧＤｓｓＥＥ?ｗｉｔｈ?ｏｒ?ｗｉｔｈｏｕｔ?０．５ｘ?ｌ〇６／ｍｌ?ｃｅｌｌｓ．??究其原因，当受到外加剪切力，多肽形成的纤维相互之间的交联被打破，??不能形成良好的三维网状结构，因此不能包裹住液体而变为粘稠的流体。而当??外加的剪切力消失之后，纤维间的相互作用会慢慢恢复，从而回复为胶体；但??低浓度的水凝胶，一方面其形成的纤维较少，另一方面其纤维更细，当外力破??坏了原有的交联结构之后，纤维之间难以重建有效的交联，因而难以完全恢复??原有的网状结构。??２．４水凝胶的自组装形貌??我们使用透射电镜（ＴＥＭ）观察ＦＡ－ＦＦＦＲＧＤｓｓＥＥ和ＦＡ－ＦＦＦｓｓ：ＥＥ水凝胶的??

（ＭＳＣｓ）进行三维培养，并在培养的不同时间点（１，３，５天）观察其形貌，同时??用活－死细胞染色检测细胞的存活。??其中，ＮＩＨ３Ｔ３细胞的培养如图１－７所示，每一列为一个浓度的水凝胶在培??养细胞不同天数的活－死细胞染色照片。我们可以观察到，第１天，细胞仍保持??比较规则的球形，并且在胶体中分布均匀，在三个不同浓度的水凝胶中，绝大??部分细胞的活力都很好（绿色圆点），死亡细胞较少（红色小点）。第三天，??０．５?ｗｔ％?（浓度最低）的胶中，大多数细胞伸展为较短的梭形（ＮＩＨ３Ｔ３正常伸??展时即为梭形），表明细胞己经开始铺展。同时，浓度较大的两个胶中也出现??了开始伸展的细胞，但是其数量较０．５０?ｗｔ％的胶少。第５天，三个浓度的胶中??大多数细胞都已呈现长梭形，表明细胞己经充分伸展，此时死亡细胞仍只有少??数。以上结果表明
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本文编号：2885852