基底硬度对人脐静脉内皮细胞黏附THP-1细胞及对其黏附相关分子表达的影响

发布时间：2017-07-06 01:08

  本文关键词：基底硬度对人脐静脉内皮细胞黏附THP-1细胞及对其黏附相关分子表达的影响

  更多相关文章： 聚丙烯酰胺水凝胶 分化抑制因子1(Id1) 血管硬度 内皮细胞 黏附相关分子

【摘要】：作为人类健康的首要“杀手”,心血管疾病(CardioVascular Disease,CVD)越发被重视。《中国心血管病报告2013》中提到,在中国心血管疾病每年剥夺近400万人的生命,每死亡5人就有2人是因心血管疾病。血管僵化是心血管疾病的普遍特征。吸烟、挑食、运动量少等不良生活习惯以及年龄的增加促使血管壁弹力蛋白含量降低,而胶原蛋白的量却与之相反的出现明显的累积,加之胶原分子间大量的交联,最终导致血管僵硬。血管的僵硬为心血管疾病的发生提供了条件。另一方面,由黏附分子以及趋化因子介导的内皮细胞与免疫细胞的黏附也是心血管疾病的关键步骤之一。有研究表明内皮细胞中与黏附相关的分子会受到多重因素的影响,如细胞所处力学环境,相关基因的异常表达,然而基底硬度变化作为心血管疾病的常见特征,是否会影响内皮细胞与其他细胞间的黏附还研究较少。如能发现血管硬度变化对内皮细胞黏附其他种细胞能力的影响,或许能给相关心血管疾病的防治开拓新的视野。在本课题研究中,我们通过调节丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例来得到不同硬度的聚丙烯酰胺水凝胶(Polyarcylamide gel,PA gel),从而模拟血管正常生理状态和病变状态下的硬度,进而分析血管壁硬度的不同对血管内皮细胞黏附人急性单核白血病细胞(Human acute monocytic leukemia cell,THP-1)以及对内皮黏附相关分子表达的影响。主要研究内容和结论如下:(1)改变丙烯酰胺(Acrylamide,AM)、甲叉双丙烯酰胺(Bis-acrylamide,Bis)的配比得到不同硬度的聚丙烯酰胺凝胶,以Sulfo-SANPAH为媒介将I型鼠尾胶原(Col-I)交联于凝胶表面从而活化凝胶。借助动静态疲劳试验机对不同配比的水凝胶的杨氏模量E进行检测,分别为11.15±0.1kPa,32.51±1.91kPa和80.64±2.11kPa,满足模拟正常血管和病变血管硬度的要求。随后,将培养于不同硬度基底上的人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)与THP-1细胞共培养分析基底硬度对内皮细胞黏附THP-1细胞能力的影响,发现在接近生理硬度(30kPa左右)时内皮细胞黏附的THP-1细胞最少。(2)为排除凝胶表面所裱称Col-I对后续实验结果的影响,利用免疫荧光技术对不同硬度水凝胶表面的Col-I进行分析,发现随着硬度的变化Col-I的结合量并没有明显变化。随后将HUVECs培养于不同硬度的水凝胶上,待细胞长至80%以上,提取细胞的总RNA和全蛋白,利用荧光定量PCR、免疫荧光和免疫印迹技术分析硬度对内皮细胞中与黏附相关的分子如血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)、细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)、单核细胞趋化因子-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)等的影响。从实验结果可以看出在正常生理硬度(30kPa左右)下内皮细胞中与黏附相关的分子的RNA转录以及蛋白表达水平均比病理硬度(10kPa左右和80kPa左右)下低。有趣的是,我们发现培养于不同硬度水凝胶上的内皮细胞中的分化抑制因子-1(inhibitors of differentiation-1,Id1)无论是mRNA水平还是蛋白水平其受影响趋势均与上述黏附相关分子一致。(3)在发现不同硬度基底上培养的内皮细胞中Id1因子的RNA转录水平、蛋白表达水平的变化趋势与黏附相关分子一致的基础上,我们构建了Id1过表达的HUVECs来研究Id1是否与基底硬度影响内皮中与黏附相关的分子的表达有关。对转染细胞中Id1的RNA转录和蛋白表达进行检测,确定获得稳定Id1高表达细胞后,通过荧光定量PCR和免疫印迹技术分析Id1过表达后内皮细胞中的与黏附相关的分子的RNA转录、蛋白表达水平。结果显示Id1过表达时黏附分子的RNA转录和蛋白表达量也都增加,类似于病理硬度水凝胶上所得结果。通过本研究工作我们发现内皮细胞生长环境的硬度变化会改变其黏附相关分子的表达,即在病理硬度情况下黏附相关分子高表达,而同样,在病理硬度下Id1也高表达。并且,过表达Id1后黏附相关分子的表达会出现上升。综上所述,我们可以得出结论,基底硬度对内皮细胞黏附相关分子的影响可能是通过Id1来介导的。
【关键词】：聚丙烯酰胺水凝胶 分化抑制因子1(Id1) 血管硬度 内皮细胞 黏附相关分子
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54
【目录】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-10
• 主要缩略词表10-11
• 1 绪论11-20
• 1.1 问题的提出与研究意义11-12
• 1.2 血管弹性模量的变化及影响因素12-13
• 1.3 血管硬度变化在心血管疾病中的影响13-14
• 1.3.1 血管硬度变化与动脉粥样硬化13
• 1.3.2 血管硬度变化与高血压13-14
• 1.4 血管硬度影响心血管疾病中内皮细胞的细胞黏附研究进展14-17
• 1.4.1 血管硬度变化概述14
• 1.4.2 心血管疾病中的细胞黏附14-16
• 1.4.3 血管硬度在调节细胞黏附相关分子中的作用和争议16-17
• 1.5 本文的研究目的、研究内容17-18
• 1.5.1 研究目的17-18
• 1.5.2 研究主要内容18
• 1.6 本课题创新点18-20
• 2 基底硬度影响内皮细胞的黏附20-29
• 2.1 引言20
• 2.2 材料与方法20-24
• 2.2.1 主要仪器和试剂20-21
• 2.2.2 硬度差异性聚丙烯酰胺水凝胶的制备21-22
• 2.2.3 不同配比聚丙烯酰胺水凝胶的杨氏模量测定22-23
• 2.2.4 共培养23
• 2.2.5 统计分析23-24
• 2.3 实验结果24-27
• 2.3.1 不同配比聚丙烯酰胺水凝胶的杨氏模量测定24-25
• 2.3.2 基底硬度影响人脐静脉内皮细胞的黏附能力25-27
• 2.4 讨论27
• 2.4.1 以聚丙烯酰胺水凝胶作为基底研究细胞行为的可行性27
• 2.4.2 细胞共培养检测方法的选择27
• 2.5 小结27-29
• 3 基底硬度影响人脐静脉内皮细胞的黏附相关分子表达29-45
• 3.1 引言29-30
• 3.2 材料与方法30-36
• 3.2.1 主要仪器和试剂30-31
• 3.2.2 不同硬度聚丙烯酰胺水凝胶表面细胞培养31-32
• 3.2.3 免疫荧光染色32
• 3.2.4 荧光定量PCR32-35
• 3.2.5 Western blot35-36
• 3.2.6 统计分析36
• 3.3 实验结果36-42
• 3.3.1 聚丙烯酰胺水凝胶表面胶原蛋白免疫荧光36-37
• 3.3.2 基底硬度影响人脐静脉内皮细胞黏附相关分子表达37-40
• 3.3.3 基底硬度对人脐静脉内皮细胞中Id1表达的影响40-42
• 3.4 讨论42-44
• 3.4.1 黏附相关分子的选择42-43
• 3.4.2 选择Id1的原因43-44
• 3.5 小结44-45
• 4 Id1影响人脐静脉内皮细胞黏附相关分子45-59
• 4.1 引言45-46
• 4.2 材料与方法46-51
• 4.2.1 主要仪器和试剂46-47
• 4.2.2 Id1过表达慢病毒载体的构建47-49
• 4.2.3 人脐静脉内皮细胞的慢病毒转染49
• 4.2.4 转染细胞荧光检测49-50
• 4.2.5 荧光定量PCR50
• 4.2.6 Western blot50
• 4.2.7 ELISA检测MCP-1 分泌50-51
• 4.2.8 统计分析51
• 4.3 实验结果51-57
• 4.3.1 Id1的慢病毒载体构建和包装51-52
• 4.3.2 人脐静脉内皮细胞的慢病毒转染鉴定52-54
• 4.3.3 Id1过表达对人脐静脉内皮细胞黏附相关分子的影响54-57
• 4.4 讨论57-58
• 4.5 小结58-59
• 5 结论与展望59-61
• 5.1 主要结论59-60
• 5.2 展望60-61
• 致谢61-62
• 参考文献62-69
• 附录69
• A. 作者在攻读硕士期间发表的论文目录69
• B. 作者在攻读硕士学位期间参与的科研项目69

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本文编号：524217