二甲双胍对尼古丁诱导肺动脉平滑肌细胞增殖的影响及机制研究

发布时间：2017-07-18 01:15

  本文关键词：二甲双胍对尼古丁诱导肺动脉平滑肌细胞增殖的影响及机制研究

  更多相关文章： 二甲双胍 尼古丁 肺动脉平滑肌细胞 磷酸腺苷蛋白激酶 细胞增殖

【摘要】：研究背景肺动脉高压(pulmonary hypertension,PH)作为慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)的重要并发症之一,直接影响了COPD患者的生活质量和预后。然而目前对于COPD相关PH尚无疗效可靠的预防和治疗措施。传统观念认为COPD肺血管床毁损、由低氧导致的肺血管收缩和血管重构是引起PH形成的主要机制,然而在治疗上基于此理论而给予的治疗手段包括氧疗、血管扩张剂及现有的用于治疗PH的药物和治疗手段并不能逆转COPD相关PH的持续进展。因此我们必须重新审视COPD相关PH的发病机制,探索肺血管重塑的潜在致病因素,以期寻找早期有效的防治方法。80-90%COPD患者与吸烟有关,研究证实吸烟致COPD患者的早期无低氧阶段,甚至在肺功能正常阶段,就已经出现了肺血管重构的现象;长期吸烟的PH患者中,其血循环中炎症因子包括白介素(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-а)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等,和平均动脉压有较强的直线相关性,高敏C反应蛋白(hs-CRP)水平可作为肺动脉高压的独立预测因子。这些证据充分阐明了,在慢性阻塞性肺病患者合并PH的肺血管重构过程中,吸烟所引起的肺血管的慢性炎症扮演了重要的角色。肺血管重构是PH的基本病理特征,其中肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cell,PASMCs)表型转化-从收缩型(分化)向合成型(未分化)转化(分化标志物SMA,SM22α等下调或消失是PASMCs表型转化的标志),是获得异常增殖/迁移、合成分泌能力致肺血管重构和肺动脉高压形成的前提和基础,尽管目前已公认香烟致慢性炎症在肺血管重构中的关键地位,但涉及其中的确切机制并未阐明,尤其是香烟暴露下调控PASMC表型转化的关键信号机制尚不清楚。调控细胞能量代谢平衡-腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)正作为调控机体氧化应激和炎症反应的重要靶点备受关注。众多的研究证据显示,机体氧化应激状态和炎症反应程度的变化与AMPK活性改变有密切的关系,AMPK活性上调可明显抑制炎症反应和基体高氧化应激状态,从而起到保护基体组织的作用。临床上广泛使用的降糖药物二甲双胍(metformin)是ampk激活剂,2009年agard等(agardc.britishjournalofpharmacology,158:1285-1294,2009)的研究显示二甲双胍抑制野百合碱和低氧诱导的ph形成,此项研究虽然未直接探讨其机制,但推测其机制可能与ampk激活有关。isoda等对内皮细胞、平滑肌细胞及巨噬细胞的研究发现,二甲双胍通过ampk抑制nf-κb激活从而降低il-1β诱导的il-6等炎症促进因子的表达水平;提示二甲双胍可能通过活化ampk,引起ampk磷酸化发挥抗炎作用。基于上述研究结果,我们推测ampk失活可能是吸烟copd患者肺血管重构过程中的关键环节,二甲双胍上调ampk活性有望抑制氧化应激、炎症反应,阻止肺血管重构和肺动脉高压形成。本研究拟通过原代培养sd(spraguedawley)大鼠肺动脉平滑肌细胞,观察二甲双胍对尼古丁(nicotine)诱导的pasmcs增殖的影响,并探讨其可能机制,最终为吸烟所致copd相关相关的防治提高新策略。研究目的1、明确不同浓度尼古丁对pasmcs增殖的影响2、明确二甲双胍对尼古丁诱导pasmcs增殖的影响;3、明确二甲双胍对尼古丁诱导pasmcs释放il-6、tnf-α及ros生成的影响;4、探讨二甲双胍对尼古丁暴露下pasmcs中ampk表达和活性的影响。材料和方法实验材料:雄性sd大鼠购自第三军医大学动物中心。实验方法:1、pasmcs的原代培养及鉴定;2、cck-8法检测不同浓度的尼古丁对pasmcs增殖的影响;3、cck-8法检测二甲双胍对尼古丁诱导pasmcs增殖的影响;4、elisa检测试剂盒检测尼古丁干预pasmcs后il-6和tnf-α释放及二甲双胍干预后il-6和tnf-α释放水平变化;5、流式细胞技术检测细胞活性氧(ros)水平6、westernblot检测pasmcs中ampk蛋白的表达和活性变化;结果1、光镜下可见,第3代细胞呈长梭形,典型的“峰-谷”样生长。免疫荧光染色可见细胞质内α-actin蛋白fitc标记的荧光二抗染成绿色,呈与细胞长轴平行的丝状分布,经DAPI染色的胞核为蓝色;2、0.1μmol/L尼古丁促PASMCs增殖效应最强(P0.05),2 mmol/L二甲双胍干预后能显著抑制尼古丁诱导的PASMCs增殖(P0.05);3、0.1μmol/L尼古丁可明显促进PASMCs中IL-6、TNF-α释放,在6 h时达峰值;二甲双胍处理后在6 h时能显著降低IL-6、TNF-α的释放水平(P0.05);4、0.1μmol/L尼古丁可显著诱导PASMCs中ROS的生成,在1 h时达峰值(P0.05),随后开始下降。而加入二甲双胍干预1 h后ROS的生成水平明显降低(P0.05);5、0.1μmol/L尼古丁处理PASMCs 1 h时,磷酸化AMPK水平显著升高,随后逐渐减低,而在各时相点AMPK表达水平无明显变化。而加入二甲双胍预处理PASMCs后,PASMCs中磷酸化AMPK水平在尼古丁处理1 h、6 h、12 h、24 h均持续活化,12 h后磷酸化AMPK水平明显升高(P0.05)。结论1、0.1μmol/L尼古丁诱导PASMCs增殖,促进PASMCs炎症因子(IL-6、TNF-α)和氧自由基的释放;伴随AMPK表达变化。2、二甲双胍显著抑制尼古丁诱导的PASMCs增殖;二甲双胍抑制尼古丁介导的PASMCs氧化应激和炎症反应。3、二甲双胍抑制尼古丁诱导的炎症反应、氧化应激及肺动脉平滑肌细胞增殖,其可能的机制是促进AMPK的持续活化。
【关键词】：二甲双胍 尼古丁 肺动脉平滑肌细胞 磷酸腺苷蛋白激酶 细胞增殖
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R544.1
【目录】：

• 中英文缩略词表4-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 PASMCs的原代培养及鉴定14-18
• 2.1 材料与方法14-15
• 2.2 实验方法15-16
• 2.3 实验结果16-17
• 2.4 讨论17-18
• 第三章 尼古丁对PASMCs增殖及炎症反应、氧化应激状态的影响18-25
• 3.1 材料与方法18-19
• 3.2 实验方法19-21
• 3.3 实验结果21-23
• 3.4 讨论23-25
• 第四章 二甲双胍对尼古丁诱导PASMCs增殖的影响及机制研究25-36
• 4.1 实验材料25-28
• 4.2 实验方法28-30
• 4.3 实验结果30-34
• 4.4 讨论34-36
• 全文结论36-37
• 本研究的创新之处37-38
• 参考文献38-41
• 文献综述 慢性阻塞性肺疾病相关性肺动脉高压的发病机制研究41-48
• 参考文献45-48
• 硕士研究生在读期间发表文章48-49
• 致谢49

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 涂洪波;白莉;;吸烟对肺血管重构的作用机制[J];中华肺部疾病杂志(电子版);2015年01期

，

本文编号：555405