miR-223-3p基因沉默对AMI大鼠CMECs血管生成的影响及其AMI患者益气活血中药干预研究

发布时间：2017-09-05 11:09

  本文关键词：miR-223-3p基因沉默对AMI大鼠CMECs血管生成的影响及其AMI患者益气活血中药干预研究

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【摘要】：目的1.前期实验研究发现益气活血中药干预前后miR-223-3p在缺血心肌微血管内皮细胞中具有差异性表达,并发现miR-223-3p可能通过影响RPS6KB1/HIF-1a信号通路抑制缺血心肌微血管内皮细胞(Cardiac Microvascular Endothelial Cells,CMECs)的迁移和增殖,从而抑制血管生成。本研究在前期实验的基础上,通过基因转染技术,进一步论证miR-223-3p抑制血管生成的机理。2.观察益气活血中药干预急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction,AMI)患者前后血浆中miR-223-3p的动态变化,探讨miR-223-3p作为急性心肌梗死标志物的可行性及灵敏度,为急性心肌梗死的诊断提供更多依据。方法1.实验研究(1)在前期实验的基础上,获取病毒载体,建立急性心梗实验动物模型,观察正常组(ZC)、模型组(MX)、转染空病毒组(AD-EGFP)、转染miR-223-3p干扰基因组(AD-miR-223-3p)血管新生的生物学特征,噻唑蓝(MTT)法绘制细胞生长曲线并检测细胞增殖能力,划痕法测定细胞迁移能力,倒置相差显微镜观察管腔结构形成情况;确定CMECs血管新生的迁移、增殖、成管的窗口期。(2)根据四组细胞增殖、迁移、成管的窗口期,取最佳感染复数(MOI)、最佳窗口期,Trizol提取四组总RNA,运用RT-PCR检测各组miR-223-3P的表达。(3)Western-blot检测靶基因及HIF-1α、VEGF、MAPK、PI3K、AKT的蛋白表达。2.临床研究(1)选择AMI住院患者28例,随机分为实验组和对照组,每组各14例。实验组给予常规西药联合益气活血中药治疗,对照组给予常规西药治疗,同时选择10例健康志愿者入组。在入院后1h、7天、14天检测两组miR-223-3p的表达情况。(2)检索文献,查找并发现miR-208及miR-133a急性心梗特异性miRNA的表达规律,比较三者的表达时间窗。结果1.实验研究(1)本研究共制作60例大鼠急性心梗模型,其中,成功存活大鼠54只,死亡6只,模型制作成功率90%。(2)腺病毒转染结果显示,接种腺病毒24小时后,6组和60组仅有少量绿色荧光表达,转染率为5%和20%;余三组均有大量绿色荧光表达,转染率分别为89%、98%、99%。接种腺病毒48小时后,6组和60组荧光表达未见增多;600组、6000组荧光表达强烈,60000组荧光表达减少,6000组和60000组孔内细胞见细胞膜破裂,大量细胞悬浮死亡。(3)ZC组、MX组、AD-EGFP组、AD-miR-223-3p组细胞增殖窗口期分别为第3天、第6天、第6天、第3天;四组细胞迁移和成管窗口期分别为第1天和第2天。ZC组和AD-miR-223-3p增殖率、迁移率和成管率均高于MX组和AD-EGFP组(P0.05)。(4)RT-PCR检测结果显示,miR-223-3p表达水平,与ZC组比较,MX组、AD-EGFP组、AD-miR-223-3p组均上调;与MX组比较,ZC组、AD-miR-223-3p组表达水平下调。与ZC组比较,MX组Rps6kb1 m RNA表达无明显差异(P0.05),AD-EGFP组Rps6kb1m RNA表达上调(P0.01),AD-miR-223-3p组表达下调(P0.05);与MX组比较,AD-miR-223-3p组Rps6kb1 m RNA的表达水平下调(P0.05),而AD-EGFP组Rps6kb1m RNA表达上调(P0.01)。四组细胞信号通路m RNA表达结果显示,与ZC组相比,MX组和AD-EGFP组MAPK、AKT和VEGF的m RNA表达均明显降低(P0.05),AD-miR-223-3p组HIF-1α、PI3K、MAPK和VEGF基因表达均明显下调(P0.05),差异有统计学意义。与MX组相比,AD-EGFP组AKT、MAPK和VEGF表达差异无统计学意义,ZC组和AD-miR-223-3p组HIF-1α、PI3K、AKT和VEGF基因均显著升高(P0.01)。(5)Western-blot检测结果回示,与ZC组比较,MX组、AD-EGFP组和AD-miR-223-3p组靶基因蛋白水平均降低(P0.01或P0.05)。与MX组比较,靶基因蛋白表达在AD-miR-223-3p组明显升高,AD-EGFP组无明显差异。四组细胞信号通路蛋白表达结果显示,与ZC组相比,MX组和AD-EGFP组MAPK、AKT和VEGF的蛋白表达均明显降低(P0.05),AD-miR-223-3p组HIF-1α、PI3K、MAPK和VEGF基因表达均明显下调(P0.05),差异有统计学意义。与MX组相比,AD-EGFP组AKT、MAPK和VEGF表达差异无统计学意义,ZC组和AD-miR-223-3p组HIF-1α、PI3K、AKT和VEGF基因均显著升高(P0.01)。2.临床研究(1)心电图疗效比较两组患者入院1小时心电图和出院前心电图结果。对照组总有效率71.43%,实验组总有效率85.71%,经秩和检验,结果具有统计学差异,实验组疗效优于对照组。(2)血浆miR-223-3p动态表达与健康志愿者相比,入院1小时所抽取肘静脉血中,AMI患者miR-223-3p表达明显升高(P=0.000.05)。而对照组与实验组在治疗前miR-223-3p表达的表达量无明显差异(P=0.6250.05)。AMI患者miR-223-3p的表达于入院是即为高峰阶段,治疗后呈持续下降趋势。治疗7天内下降最为明显,而14天后趋于平稳。两组患者miR-223-3p的表达治疗后均较治疗前降低,而应用益气活血中药治疗后效果更明显(P0.05)。结论1.腺病毒转染缺血CMECs的最佳MOI在300-600之间,转染时间于12-18小时可达到最大转染效率,而且对细胞损伤较小。2.miR-223-3p沉默,可以促进CMECs的增殖、迁移、成管过程,进而促进血管新生。3.进一步证实miR-223-3p是通过Rps6kb1/HIF-1α信号通路使血管生成关键分子VEGF、p38 MAPK、PI3K、AKT等表达水平升高,促进缺血心肌血管生成。4.心肌梗死发病初始,miR-223-3p较miR-133和miR-208会更早进入窗口期。
【关键词】：益气活血中药 急性心肌梗死 mir-223-3p 腺病毒转染
【学位授予单位】：山东中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R542.22
【目录】：

• 提要3-6
• abstract6-10
• 英汉缩略语名词对照10-15
• 引言15-17
• 第一部分 实验研究17-51
• （一）miR2233p沉默大鼠缺血CMECs的生物学特性17-33
• 1 实验材料17-18
• 1.1 实验动物17
• 1.2 主要仪器17-18
• 1.3 主要试剂18
• 2 试验方法18-21
• 2.1 大鼠急性心梗（AMI）模型制作 结扎法18-19
• 2.2 缺血心肌微血管内皮细胞的培养植块法19
• 2.3 腺病毒转染大鼠缺血CMECs19-20
• 2.4 各组CMECs的生物学特性20-21
• 2.5 统计学分析21
• 3 结果21-29
• 3.1 大鼠急性心梗模型制作结果21-22
• 3.2 大鼠缺血CMECs的生长情况22-23
• 3.3 腺病毒转染结果23-26
• 3.4 细胞生长曲线26
• 3.5 迁移结果26
• 3.6 CMECs成管情况26-28
• 3.7 各组CMECs生长窗口期和增殖率、迁移率、成管率情况28-29
• 4 讨论29-33
• （二）miR2233p沉默对缺血CMECs血管新生功能的影响33-51
• 1 实验材料33-37
• 1.1 实验动物33
• 1.2 主要仪器33-34
• 1.3 主要试剂34
• 1.4 主要溶液配制方法34-37
• 2 实验方法37-43
• 2.1 RT-PCR检测miR2233p及相关靶基因表达38-41
• 2.2 Western-blot[32]检测靶基因蛋白表达41-42
• 2.3 统计学分析42-43
• 3 结果43-48
• 3.1 各组miR2233p差异表达43-45
• 3.2 Rps6kb1的mRNA和蛋白表达情况45-46
• 3.3 信号通路mRNA和蛋白表达46-48
• 4 讨论48-51
• 第二部分 临床研究 益气活血中药干预miR2233p对急性心肌梗死诊断价值51-62
• 1 资料与方法51-53
• 1.1 受试者的选择51-52
• 1.2 受试者分组52
• 1.3 治疗药物52-53
• 1.4 观察指标53
• 1.5 统计学分析53
• 2 结果53-59
• 2.1 一般资料53-56
• 2.2 治疗前后心电图疗效评价56-57
• 2.3 循环血中miR2233p表达情况57-59
• 2.4 miR2233p、miR-133a和miR-208的动态表达59
• 3 讨论59-62
• 结语62-63
• 参考文献63-67
• 综述67-75
• 参考文献72-75
• 附录75-83
• 发表论文83-85
• 参加课题85-87
• 致谢87-89
• 附件89-99

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