大鼠心肌缺血再灌注损伤病理机制及STVNa保护作用的蛋白质组学研究

发布时间：2017-09-13 04:29

  本文关键词：大鼠心肌缺血再灌注损伤病理机制及STVNa保护作用的蛋白质组学研究

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【摘要】：心血管疾病是造成全球死亡率居高不下的首要因素,缺血再灌注损伤作为急性心肌梗死的主要原因被广泛关注。探讨心肌缺血再灌注损伤的病理机制,寻找有效的药物作用靶点,蛋白质组学研究尤为重要。本文以差异蛋白组学方法对Sprague Dawley(SD)大鼠在体心肌缺血再灌注损伤的病理机制及异甜菊醇钠(STVNa)的心肌保护作用进行了研究,提出了缺血及再灌注损伤导致能量代谢通路变化及STVNa保护作用来自提升脂肪酸代谢水平的初步结论。具体来说,首先成功构建了如下三组模型:(1)心肌缺血模型(结扎左冠状动脉前降支30分钟,生物学重复样品数n=3),(2)缺血再灌注模型(缺血30分钟,去结扎再灌注120分钟,n=3),(3)STVNa后处理模型(去结扎再灌注同时颈静脉给予STVNa 120分钟,n=3)。为克服个体差异,蛋白组学分析的样品取材采用了自身对照的方法,即切取每只大鼠心脏的正常区域与缺血区域进行对比。对所得心脏组织的蛋白组学分析采用基于非变性一维凝胶电泳(one-dimensional gel electrophoresis,1DE)?凝胶胶条网格切取?定量液相色谱串联质谱联用(liquid chromatrography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)的策略:提取组织水溶性蛋白,以非变性1DE分离后,对1DE凝胶胶条(1.1 mm宽×42-44 mm高×1 mm厚)进行网格式的切取,即在全长(分子量)范围内无差别地均匀划分为相同尺寸的凝胶方块(1.1 mm宽×1.1 mm高)(对每块凝胶均选取两条胶条平行处理,即分析重复样品数n=2);各凝胶方块均以标准化程序进行胶内酶解、肽段提取和非标记定量标准品添加等处理;所得各凝胶方块对应的肽段样品以LC-MS/MS进行鉴定及非标定量;汇总各凝胶方块所含蛋白质种类及含量,重构1DE胶条上各蛋白的总量及(沿表观分子量的)含量分布。每个组学样品检测到的蛋白质种类为1300-1900种,含量范围跨越5个数量级,且各蛋白均对应其特异性的含量分布(非变性蛋白质谱图)。组学数据的处理依次为:提取分析重复样品中(n=2)共同检测到的蛋白质;对比同一只大鼠心脏正常区域与缺血区域的差异蛋白质(共同检测到且含量差异≥1.5倍或≤0.67倍,即上调或下调);对比动物模型分组内(n=3)不同个体间差异蛋白质情况,提取至少在两个个体中具有相同变化趋势的蛋白质。结果表明,缺血、缺血再灌注、STVNa后处理分别导致100、392和397种蛋白质发生差异表达,上调/下调蛋白数分别为23/77、178/214和166/231。对所得差异蛋白质的功能和作用网络进行初步分析,结果表明:这些蛋白质的功能主要集中在糖代谢、脂肪酸代谢、呼吸链和氧化应激等方面。缺血导致脂肪酸代谢通路中的多种关键酶下调,呼吸链成员蛋白质下调;再灌注导致部分脂肪酸氧化的关键酶上调,部分脂肪酸转运的关键酶下调,葡萄糖代谢的多种关键酶上调,呼吸链成员蛋白质下调,高能分子合成关键酶如肌酸激酶上调,同时造成多种结构相关蛋白质下调,与单纯缺血处理相比还显示了炎症和凋亡因子的出现;再灌注同时给予STVNa(与再灌注组相比)造成脂肪酸和葡萄糖代谢、呼吸链和氧化磷酸化的多种关键酶上调,多种结构相关蛋白质上调。这些结果提示了缺血及再灌注损伤导致能量代谢通路变化,且再灌注损伤会进一步造成细胞结构损伤并出现炎症和细胞凋亡;与再灌注组相比,给予STVNa不仅能够稳定细胞结构,更显著提高了脂肪酸代谢、呼吸及氧化磷酸化水平,提示给药改善了缺血和再灌注损伤造成的能量通路间的转变。综述之,本工作旨在探讨心肌缺血再灌注损伤的病理机制及STVNa的心肌保护作用机理,为此(1)建立了SD大鼠在体心肌缺血、再灌注和STVNa后处理的实验动物模型,设计了3×3的实验动物分组;(2)对每只个体心脏的正常区域和缺血区域进行了非变性差异蛋白组学分析;(3)对所得大规模组学数据进行了初步分析,提出了差异蛋白质列表和可能的分子机制,提出了STVNa心肌保护作用来自于提升脂肪酸代谢和稳定细胞结构的初步结论。
【关键词】：心肌缺血再灌注损伤 非变性蛋白质组学 差异表达 相互作用 能量代谢
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R54;Q503
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 缩略词表12-14
• 第一章 绪论14-27
• 1.1 心肌缺血再灌注损伤14-19
• 1.1.1 概述14-15
• 1.1.2 病理机制研究15-19
• 1.2 差异蛋白质组学分析19-22
• 1.2.1 概述19
• 1.2.2 常用研究方法19-22
• 1.3 心肌缺血再灌注损伤差异蛋白质组学研究现状22-23
• 1.4 研究背景、意义和内容23-27
• 1.4.1 研究背景23-24
• 1.4.2 研究意义24-25
• 1.4.3 研究内容25-27
• 第二章 大鼠在体心肌缺血、再灌注及STVNa后处理模型的构建及动物实验分组27-35
• 2.1 引言27
• 2.2 材料与方法27-32
• 2.2.1 实验材料与仪器27-28
• 2.2.2 实验动物和手术器械28
• 2.2.3 实验方法28-32
• 2.3 结果与讨论32-33
• 2.4 本章小结33-35
• 第三章 在体心肌缺血再灌注的差异蛋白质组学分析35-78
• 3.1 引言35-36
• 3.2 材料与方法36-45
• 3.2.1 实验仪器与材料36-39
• 3.2.2 实验方法39-45
• 3.3 结果与讨论45-76
• 3.3.1 非变性 1DE结果45-49
• 3.3.2 各模型中缺血区域与正常区域水溶性蛋白质的数据处理49-55
• 3.3.3 各模型中缺血区域与正常区域水溶性蛋白质的差异表达55-58
• 3.3.4 差异蛋白质参与的信号通路及功能分析58-72
• 3.3.5 STRING分析差异蛋白质的相互作用网络72-76
• 3.4 本章小结76-78
• 第四章 CBB对基于凝胶电泳的蛋白质组学检测的影响78-91
• 4.1 引言78-79
• 4.2 材料与方法79-86
• 4.2.1 实验仪器与试剂79-81
• 4.2.2 实验方法81-86
• 4.3 结果与讨论86-90
• 4.3.1 非变性 1DE是否CBB染色的LC-MS检测结果比较86-89
• 4.3.2 SDS-PAGE是否CBB染色的LC-MS检测结果比较89-90
• 4.4 本章小结90-91
• 结论与展望91-93
• 结论91-92
• 创新之处92
• 展望92-93
• 参考文献93-104
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果104-106
• 致谢106-107
• 附件107

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

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本文编号：841529