激动TGR5对乳小鼠心肌成纤维细胞分泌胶原蛋白的影响及其机制

发布时间：2017-09-20 04:38

  本文关键词：激动TGR5对乳小鼠心肌成纤维细胞分泌胶原蛋白的影响及其机制

  更多相关文章： TGR5 胶原蛋白Ⅰ型 胶原蛋白Ⅲ型 心肌成纤维细胞 P38-MAPK Nrf2 HO-1

【摘要】：目的:研究激动TGR5对乳小鼠心肌成纤维细胞胶原蛋白分泌的影响,并探讨可能存在的机制。方法:1、原代培养乳小鼠心肌成纤维细胞(cfs)及鉴定:取3-5天乳小鼠,处死后取心脏的心尖部分,胰酶消化后用差速贴壁法培养7-10天左右传代,取3代细胞用特异性抗体荧光免疫法鉴别。2、荧光定量PCR检测心肌成纤维细胞上TGR5 m RNA表达:提取生长良好的3代心肌成纤维细胞的RNA,同时分别提取肝脏、脾脏和心脏组织的RNA用于对比,检测RNA的浓度及纯度后,进行c DNA的反转录合成,委托上海生工生物有限公司设计、合成TGR5引物,上机进行目的基因的定量检测。3、TGR5过表达慢病毒的制备与包装:利用限制性内切酶消化后得到线性化载体。PCR扩增制备目的基因片段。以GV358作为工具载体质粒,同Helper 1.0质粒及Helper 2.0质粒共转染293T细胞,48-72 h后进行病毒收获,离心浓缩和纯化后得到高滴度的慢病毒,分装保存,并进行病毒质量检测。4、TGR5过表达慢病毒感染心肌成纤维细胞,上调细胞膜上TGR5表达:取3代生长良好的心肌成纤维细胞,分为正常细胞组、空病毒组、TGR5过表达慢病毒组(cfs-v),孵育24h,荧光显微镜下观察荧光显色并用PCR法检测细胞膜上TGR5 m RNA的表达变化,用Western Blot法检测细胞内TGR5的蛋白水平。5、小鼠胶原蛋白酶联免疫检测试剂盒检测胶原蛋白I型和III型:用吸管分别吸取各组培养基于10ml离心管中,离心后得到上清液,加入酶标板中,经温育、洗涤、显色、终止、测定得到各组OD值用excel、SPSS等软件分析数据。6、c AMP试剂盒检测胞内c AMP含量:胰酶消化收集上述各组细胞,经反复冻存,使细胞内成分完全裂解,离心后取上清液,加入酶标板中,经温育、洗涤、加酶、显色、终止、测定得到各组OD值用excel、SPSS等软件分析数据。7、探索激动TGR5影响胶原蛋白分泌的机制:实验分组:(1)空白组(cfs组),(2)对照组(cfs-v组)(3)cfs-v+nomilin组,(4)cfs-v+nomilin+BIRB-796组。取2代cfs及cfs-v接种于6孔板上,正常培养2天,当贴璧细胞达到90%时加入含BIRB-796的培养基(BIRB-796终浓度为10μmol/l)干预1小时,然后加入诺米林(nomilin)(50mmol/l,20μl/孔)作用24小时。分别提取上述各组细胞的总蛋白及核蛋白,运用考马斯亮蓝染色法测定得到蛋白浓度,以GAPDH为内参,将处理好的蛋白质样品进行分离、转膜、封闭,依次孵育一抗和二抗、显色、成像后,将获得图像用图像处理软件Image J测定并分析条带灰度值以检测p-P38、Nrf2、HO-1的蛋白的表达水平。结果:1、原代培养乳小鼠心肌成纤维细胞成功。2、荧光定量PCR结果显示:cfs上TGR5 m RNA的表达量明显少于心脏、肝脏和脾脏,差异有统计学意义,P0.05。3、成功制备TGR5过表达慢病毒:克隆测序结果证实目标基因成功连接入酶切载体。检测病毒滴度为2E+8TU/ml。4、成功建立过表达TGR5的心肌成纤维细胞模型:4.1荧光显微镜下可见感染TGR5过表达慢病毒的心肌成纤维细胞(cfs-v)有大量荧光表达,感染率为90%。4.2 RT-PCR检测结果显示:cfs-v上TGR5 m RNA表达量较cfs明显增多,P0.05。4.3 Western Blot结果显示:cfs-v内TGR5的蛋白含量较cfs明显增多,P0.05。5、c AMP试剂盒检测胞内c AMP含量的结果显示:cfs-v+nomilin组细胞内c AMP含量较cfs组及cfs-v组均明显升高,P值均0.05。6、ELISA试剂盒检测胶原蛋白I型和III型的结果显示:cfs-v+nomilin组细胞分泌的I型和III型胶原蛋白较cfs组及cfs-v组均明显降低,P值均0.05。cfs-v+nomilin+BIRB-796组与cfs-v+nomilin组相比,胶原蛋白I型和III的含量增多,P0.05。7、Western Blot法检测各组内p-P38、Nrf2及HO-1的蛋白水平,结果显示:cfs-v+nomilin组细胞内p-P38、Nrf2及HO-1的蛋白水平较cfs-v组均明显升高,P值均0.05。cfs-v+nomilin+BIRB-796组的上述三种蛋白含量较cfs-v+nomilin组明显减少,P均0.05。结论:1、激动TGR5能减少乳小鼠心肌成纤维细胞分泌胶原蛋白I型和III型。2、TGR5激活后可能通过P38途径引起Nrf2核转位启动HO-1表达,抑制心肌成纤维细胞分泌胶原蛋白。3、P38-Nrf2信号通路可能是TGR5参与抑制心肌纤维化的众多信号途径之一。
【关键词】：TGR5 胶原蛋白Ⅰ型 胶原蛋白Ⅲ型 心肌成纤维细胞 P38-MAPK Nrf2 HO-1
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R542.2
【目录】：

• 摘要3-6
• Abstract6-10
• 前言10-12
• 材料与方法12-34
• 结果34-48
• 讨论48-54
• 结论54-55
• 参考文献55-60
• 英汉缩略词对照表60-61
• 致谢61-62
• TGR5与代谢综合征 综述62-72
• 参考文献67-72

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 陈勇兵,陈如坤,陈力,吴明,施立,杨文涛,钱永跃;乳鼠心肌成纤维细胞培养方法的改进[J];江苏医药;2005年03期

2 李明焕,田铧,孙云,刘执玉;心肌成纤维细胞诱导体外血管新生的实验研究[J];河北医科大学学报;2005年03期

3 杨文涛;施立;陈勇兵;钱永跃;;心肌成纤维细胞成为基因靶细胞的可行性研究[J];苏州大学学报(医学版);2006年01期

4 苗春生;张丹;李相军;;硒和维生素E对心肌成纤维细胞 Ⅰ型胶原合成代谢的影响[J];吉林大学学报(医学版);2006年03期

5 赵智明;蔡辉;;心肌成纤维细胞的来源、特征及意义[J];中国微循环;2006年03期

6 肖华;季爱民;李志粱;宋旭东;陈爱华;;氧化低密度脂蛋白对大鼠心肌成纤维细胞胶原的影响[J];第三军医大学学报;2008年13期

7 赵蕾;齐永芬;;心肌成纤维细胞在心肌细胞适应性反应中发挥重要作用[J];生理科学进展;2010年05期

8 段卡丹;李裕舒;史晓婧;;房颤患者血清对心肌成纤维细胞趋化运动的影响[J];中国病理生理杂志;2011年04期

9 郝嘉;游凯;肖颖彬;;心肌成纤维细胞的特性和调节[J];心血管病学进展;2011年03期

10 方敏;李世玲;王俊宏;郭妍;;晚期糖基化终产物对心肌成纤维细胞的老化及纤维化的影响[J];南京医科大学学报(自然科学版);2014年01期

中国重要会议论文全文数据库 前4条

1 蒋芳萍;张晓刚;丘彦;李卫东;常静;;心肌细胞或心肌组织中的成纤维细胞对胚胎干细胞定向分化诱导作用的研究[A];中华医学会心血管病学分会第十次全国心血管病学术会议汇编[C];2008年

2 颜素娟;李菊香;陈静;苏海;罗伟;程晓曙;吴清华;吴延庆;;心肌营养素-1在高静水压刺激心肌成纤维细胞增殖中的作用[A];中华医学会心血管病分会第八次全国心血管病学术会议汇编[C];2004年

3 陈超;杜建海;张幼怡;;β肾上腺素受体经cAMP/Epac/PKC信号通路介导心肌成纤维细胞分泌IL-6[A];中国病理生理学会第九届全国代表大会及学术会议论文摘要[C];2010年

4 杨宝峰;张勇;单宏丽;初文峰;吕延杰;;微小RNA——心血管疾病药物研发新靶点[A];2013年中国药学大会暨第十三届中国药师周论文集[C];2013年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 李睿;MicroRNA-7a/b在AngiotensinⅡ诱导的心肌成纤维细胞及小鼠心梗后心肌纤维化中的作用[D];山东大学;2015年

2 余杨;KLF15对心肌纤维化调控作用的研究[D];第三军医大学;2016年

3 赵建全;Trim72在大鼠心力衰竭中的作用及初步机制研究[D];重庆医科大学;2016年

4 戴斌;STAT1/3与ERK1/2通路协同调控高糖诱导的鼠CFs增殖和胶原合成[D];天津医科大学;2016年

5 韩永生;表没食子儿茶素没食子酸酯对血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠心肌成纤维细胞功能的影响及分子机制研究[D];山东大学;2013年

6 张文琪;炎症刺激因子政Activin A-FS表达失衡在心肌间质重构中作用的研究[D];吉林大学;2012年

7 周秀娟;MyoD基因局部转染心肌成纤维细胞用于心肌重建的实验研究[D];南京医科大学;2006年

8 陈勇兵;假型病毒载体介导tPA基因转导乳鼠心肌成纤维细胞的实验研究[D];浙江大学;2004年

9 张冀东;阿托伐他汀逆转醛固酮致心肌成纤维细胞增殖的机制探讨[D];河北医科大学;2008年

10 方欣;经典的瞬时受体电位通道蛋白-1在血管紧张素Ⅱ促心肌纤维化中的作用及缬沙坦干预研究[D];华中科技大学;2009年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 陈泽文;MicroRNA-29a对心肌成纤维细胞活化增殖的调控机制研究[D];安徽医科大学;2016年

2 巨媛媛;TWEAK通过ERK1/2通路促进大鼠心肌成纤维细胞MMP2与Ⅰ型胶原表达[D];山东大学;2016年

3 刘畅;IL-22对体外培养的小鼠心肌成纤维细胞胶原Ⅰ表达的影响[D];广西医科大学;2016年

4 张源;β3-AR对AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞纤维化作用的机制研究[D];石河子大学;2016年

5 吴建利;TGR5对血管紧张素Ⅱ诱导乳小鼠心肌成纤维细胞增殖的影响及机制[D];西南医科大学;2016年

6 于瑞;加参方对TGF-β1诱导的大鼠心肌成纤维细胞功能的影响及作用机制的初步探讨[D];河南中医药大学;2016年

7 郑建梅;激动TGR5对乳小鼠心肌成纤维细胞分泌胶原蛋白的影响及其机制[D];西南医科大学;2016年

8 林真;目的基因过表达慢病毒颗粒感染人心肌成纤维细胞的实验研究[D];福建医科大学;2010年

9 陈玲;血小板反应蛋白1在转化生长因子β1诱导的大鼠心肌成纤维细胞中的作用[D];南昌大学;2007年

10 刘璐;水凝胶基底力学环境下心肌成纤维细胞生物学研究[D];山东师范大学;2015年

，

本文编号：885983