PiggyBac介导多药物代谢酶稳定表达肝细胞系的建立

发布时间：2017-04-28 14:05

  本文关键词：PiggyBac介导多药物代谢酶稳定表达肝细胞系的建立，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：药物安全性评价是新药开发的重要内容。而肝脏作为药物代谢和毒性反应的靶器官在药物安全性评价中起着至关重要的作用。原代肝细胞作为一种金标准广泛用于药物评价,然而受到伦理道德、供体遗传背景差异、来源有限及体外培养不稳定等影响极大地限制了其应用,因此越来越多的研究集中于体外肝细胞模型。Hep G2细胞来源于肝脏,仍然保留了肝脏细胞许多功能性特征且可在体外稳定传代培养,是体外肝毒性评价常用的细胞模型。但是与原代肝细胞相比,Hep G2细胞药物代谢酶表达水平不高严重影响该模型进一步应用于药物代谢和毒性评价。本研究采用高效转座子基因转移技术和细胞单克隆培养技术相结合,制备药物代谢酶CYP3A4和CYP2C19同时稳定表达转基因Hep G2细胞系。研究首先构建CYP3A4和CYP2C19两基因共表达的重组转座子并将其转染Hep G2细胞,经流式细胞分选和细胞有限稀释,采用细胞克隆环技术获得21株嘌呤霉素抗性单克隆细胞。抗性克隆扩大培养,经倒置相差荧光显微镜观察,挑选3株状态良好的抗性单克隆细胞进行鉴定分析。分别应用实时荧光定量PCR、免疫印迹法以及LC-MS/MS检测细胞CYP3A4及CYP2C19的m RNA,蛋白水平和酶活性水平。实验结果显示:筛选的3株抗性单克隆细胞的药物代谢酶基因CYP3A4和CYP2C19的m RNA相对表达量显著高于与未转染细胞;经Western Blot检测分析,抗性单克隆细胞均能成功表达相对分子量约48k Da和56k Da药物代谢酶CYP3A4和CYP2C19;在酶活性水平检测中,将抗性单克隆细胞与药物代谢酶CYP3A4和CYP2C19的底物作用,生成的6β-Hydroxytestosterone和4-Hydroxymephenytoin产生速率显著高于未转染细胞,表明转基因细胞系具有活性。最终获得药物代谢酶CYP3A4和CYP2C19稳定表达Hep G2细胞系。
【关键词】：PiggyBac HepG2 药物代谢 毒理
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 第一章 绪论10-20
• 1.1 药物体外肝代谢模型研究现状10-12
• 1.2 转座子概述12-15
• 1.2.1 转座子的分类12-13
• 1.2.2 piggyBac转座子与及作用机制13-15
• 1.3 多基因共表达的研究进展15-18
• 1.3.1 多基因共表达的研究现状15-16
• 1.3.2 2A基因的作用机理和研究现状16-18
• 1.4 本课题研究思路18-20
• 第二章 重组转座子PB-CYP3A4-P2A-CYP2C19 的构建20-31
• 2.1 实验材料20-21
• 2.1.1 主要仪器和设备20
• 2.1.2 菌株及质粒20
• 2.1.3 主要实验试剂20-21
• 2.1.4 实验相关试剂和培养基配制21
• 2.2 实验方法21-26
• 2.2.1 CYP3A4 和CYP2C19 基因的克隆22-25
• 2.2.2 构建PB-CYP3A4-P2A-CYP2C19 重组转座子质粒25-26
• 2.3 实验结果26-29
• 2.3.1 CYP3A4 和CYP2C19 基因的克隆26-27
• 2.3.2 重组质粒pMD-18T-CYP3A4-P2A-CYP2C19 双酶切鉴定27-28
• 2.3.3 重组质粒PB-CYP3A4-P2A-CYP2C19 双酶切鉴定28-29
• 2.4 讨论与小结29-31
• 第三章 转座子介导HepG2 单克隆细胞系的建立31-44
• 3.1 实验仪器与材料31-32
• 3.1.1 主要仪器设备31
• 3.1.2 实验材料31
• 3.1.3 实验相关试剂配制31-32
• 3.2 实验方法32-36
• 3.2.1 无内毒素质粒的制备32
• 3.2.2 筛选大片段质粒DNA转染HepG2 细胞最佳方法32-35
• 3.2.3 Puromycin对HepG2 细胞毒性试验35
• 3.2.4 质粒转染HepG2 细胞35-36
• 3.2.5 抗性细胞克隆的获得36
• 3.3 实验结果36-42
• 3.3.1 无内毒素质粒DNA纯化试剂盒提取质粒和纯度测定36-37
• 3.3.2 Puromycin对HepG2 细胞毒性试验结果37
• 3.3.3 三种转染方法对HepG2 细胞转染效率比较37-41
• 3.3.4 细胞单克隆化41-42
• 3.4 讨论与小结42-44
• 第四章 稳定表达人药物代谢酶HepG2 细胞系的鉴定及酶活性分析44-58
• 4.1 实验仪器与材料44-46
• 4.1.1 实验主要仪器44
• 4.1.2 实验材料44-45
• 4.1.3 实验试剂配制45-46
• 4.2 实验方法46-53
• 4.2.1 抗性细胞克隆转录水平鉴定46-49
• 4.2.2 Western Blot检测药物代谢酶基因CYP3A4 和CYP2C19 基因表达49-50
• 4.2.3 LC-MS/MS测定单克隆细胞对睾酮和美分妥因代谢能力50-53
• 4.3 实验结果53-57
• 4.3.1 细胞总RNA电泳检测53
• 4.3.2 CYP3A4,CYP2C19 基因mRNA水平Real-Time PCR检测结果53-54
• 4.3.3 BCA法测细胞中蛋白浓度54
• 4.3.4 Western blot结果54-55
• 4.3.5 CYP3A4 和CYP2C19 表达蛋白活性测定55-57
• 4.4 讨论与小结57-58
• 结论与展望58-61
• 参考文献61-67
• 附录 CYP3A4-P2A-CYP2C19 基因测序结果比对67-73
• 攻读博士/硕士学位期间取得的研究成果73-74
• 致谢74-75
• 附件75

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前9条

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