与石房蛤毒素特异结合的适配体的优化及其验证

发布时间：2017-04-29 02:10

  本文关键词：与石房蛤毒素特异结合的适配体的优化及其验证，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：石房蛤毒素(STX)是麻痹性贝类毒素家族中的一员,由海洋藻类合成后,通过食物链作用富集于甲壳类和软体动物体内,经人类和海洋动物食用后产生麻痹性贝类中毒。该毒素主要通过阻断可兴奋细胞表面的钠离子通道产生毒性效应。为了保证人类的健康不受威胁,对STX进行检测尤为重要。然而,STX的检测,尤其是快速检测中,最关键的部分是STX的分子识别元件。核酸适配体是通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选出来的能够与多种靶分子如药物,蛋白质,其他无机或有机分子高亲和力高特异性地结合的一小段寡核苷酸序列(DNA或RNA)。相对于抗体,它有着多种自身优势,包括其稳定性,低免疫原性,易于自动化学合成等,已作为分子识别元件应用于靶分子检测,疾病诊断,疾病治疗等多方面。为了找到候选的STX分子识别元件,先前Handy等人已经通过SELEX技术筛选出一条DNA适配体,APTSTX1。然而,它的动力学参数,关于功能的研究以及筛选后的优化都没有得到相关报道,这些对于改善其特性从而更好地应用都是必要的。由于PCR的扩增偏性和实验操作导致的文库多样性降低等原因,一些与靶分子高亲和力结合的适配体无法通过SELEX技术筛选出来。多个团队成功地通过突变的方法对已经筛选得到的适配体进行优化,并获得比原始序列亲和力更高却未被筛选出来的序列。本研究中,我们采用类似的方法,在理性分析的基础上对ApTSTX1进行突变,期望得到潜在的具有更高亲和力的适配体。G-四联体是一种高度有序高稳定性的核酸空间结构,如果经过突变适配体能够形成G-四联体结构,则可能会与靶分子结合地更紧密,表现出更高的亲和力。因此,我们设计了多条突变序列(包括单点突变及多点突变),将鸟嘌呤核苷酸任一端或两端的核苷酸也突变为鸟嘌呤核苷酸,因为鸟嘌呤核苷酸为G-四联体结构所必需。借助QGRS Mapper软件进行结构预测,我们将可能折叠成G-四联体结构的序列进行合成并采用生物膜干涉的方法进行亲和力测定。其中部分序列与APTSTX1相比亲和力得到提高,而亲和力最高的是M-30,比APTSTX1提高了30倍。在此基础上,我们对M-30进一步截短,分别将两端的游离序列和四个茎-环结构逐个移除,并进行亲和力测定。通过对这些截短序列的结构与亲和力之间的关系进行分析,我们发现其结合STX的核心序列是5’端的两个茎-环结构。将其他多余的核苷酸移除后,我们得到M-30f,通过生物膜干涉的方法测得其Kd值为133nM,与M-30相比亲和力并未明显下降。最后,通过多种方法(ELISA,细胞生物学分析和小鼠生物检测),我们对优化前后的两条适配体(APTSTX1及M-30f)进行了亲和力比较,并对它们的STX抑制活性进行了评价。两条适配体与STX结合的能力在三种方法中都得到验证。ELISA和细胞生物学测定的结果表明,STX与APTSTX1、M-30f的相互作用间存在显著的统计学差异,M-30f的结合能力更强,并且两条适配体均可以拮抗STX的钠离子通道抑制活性,而M-30f的抑制效果更好。总之,优化后的序列,M-30f,性能优于其母序列。作为STX的分子识别元件,M-30f具有更好的实际应用前景。此外,理性的定点突变和截短是可行的筛选后优化策略,这个结论在本研究中也得到证实。
【关键词】：适配体 石房蛤毒素 突变 截短 抑制活性 G-四联体
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R96;R943
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 缩略词表10-12
• 前言12-14
• 实验材料14-16
• 第一部分、适配体APT~(STX1)的验证及优化16-29
• 一、实验方法16-19
• (一)、生物膜干涉技术16
• (二)、对APT~(STX1)与STX结合的亲和力及特异性进行评价16-18
• (三)、对APT~(STX1)进行优化(突变)18-19
• (四)、对突变序列M-30进一步优化(截短)19
• (五)、作图19
• 二、实验结果19-28
• (一)、适配体APT~(STX1)可以与STX结合,而与STX的类似物不结合19-20
• (二)、对APT~(STX1)进行突变后,亲和力提高20-24
• (三)、对突变序列M-30进行截短,找到M-30的最短序列M-30f24-28
• 三、小结28-29
• 第二部分、采用多种方法对优化前后的两条适配体(APT~(STX1)及M-30f)进行比较29-40
• 一、实验方法29-33
• (一)、酶联免疫吸附实验(ELISA)29-31
• (二)、细胞生物学测定31-32
• (三)、MBA32-33
• (四)、统计学分析33
• 二、实验结果33-39
• (一)、M-30f的STX结合能力优于APT~(STX1)(ELISA)33-35
• (二)、M-30f的STX结合能力优于APT~(STX1)(细胞水平)35-37
• (三)、M-30f和APT~(STX1)均可以与STX结合(MBA)37-39
• 三、小结39-40
• 讨论40-43
• 全文总结43-44
• 参考文献44-48
• 综述48-59
• 参考义献56-59
• 在读期间发表论文情况59-60
• 致谢60

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 张悦;邢仕歌;王震;康庆贺;凌云;姚美伊;何彦平;金涌;储晓刚;;核酸适配体在靶向药物传递中的研究进展[J];生物化学与生物物理进展;2015年03期

2 刘继红;胡颖;洪慧杰;张玲;王红旗;;赭曲霉毒素A核酸适配体筛选[J];食品安全质量检测学报;2015年09期

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1 陈章;新型生物传感器的构建及其在环境和生物检测中的应用研究[D];湖南大学;2012年

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1 朱莹;多西紫杉醇核酸适配体的高效筛选及其特性的初步考察[D];湖南大学;2013年

2 MICHAEL JOHN DONOVAN;[D];湖南大学;2013年

3 何咏;功能化荧光核酸探针用于腺苷和pH的检测[D];湖南大学;2014年

4 郭晓东;黄曲霉毒素适配体传感器检测方法建立及其稳定性研究[D];新疆农业大学;2014年

5 梁少君;硫酸软骨素共价修饰PAMAM传递miR-34a治疗CD44阳性肿瘤的研究[D];吉林大学;2015年

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本文编号：334007