构建辅酶自循环系统全细胞催化环氧化物合成1,2-氨基醇类化合物
发布时间：2022-08-01 11:23
1,2-氨基醇类化合物是一种重要的医药中间体,广泛应用于神经递质及抗病毒制剂等多种具有生理活性药物的合成,因此探索1,2-氨基醇类化合物的高效合成方法对于发展该类药物具有重要意义。与化学法相比,生物法由于其转化率高,立体选择性强,反应条件温和等特点而得到广泛关注。本研究基于新鉴定的Pseudomonas aeruginosa PAK来源的ω-转氨酶（PAKω-TA）,设计了一个结合环氧化物水解酶（SpEH）和醇脱氢酶（MnADH）的多酶级联催化体系,从而将较为廉价的环氧化合物一步催化合成具有高附加值的1,2-氨基醇类化合物;为了解决反应过程中的限速步骤,通过RBS优化以提高醇脱氢酶在重组菌中的表达量;另外本研究在该级联催化体系中引入大肠杆菌来源的谷氨酸脱氢酶（GluDH）,构建了一个封闭的辅酶自循环系统,从而实现辅酶NADP+和辅底物L-Glu的同时再生。（1）以Chromobacterium violaceumω-转氨酶的蛋白序列作为基因探针,在基因数据库中进行BLAST同源性比对,P.aeruginosa PAK来源的“β-消除裂解酶家族蛋白”与C.violaceumω-转氨酶具有...
【文章页数】：50 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 1,2-氨基醇类化合物的概述及合成方法
1.1.1 1,2-氨基醇类化合物简介
1.1.2 1,2-氨基醇类化合物的化学合成
1.1.3 1,2-氨基醇类化合物的化学酶法合成
1.1.4 1,2-氨基醇类化合物的生物法合成
1.2 ω-转氨酶
1.2.1 ω-转氨酶简介
1.2.2 ω-转氨酶的研究现状
1.3 环氧化物水解酶,醇脱氢酶和谷氨酸脱氢酶概述
1.3.1 环氧化物水解酶
1.3.2 醇脱氢酶
1.3.3 谷氨酸脱氢酶
1.4 辅酶自循环系统及多酶组装
1.4.1 辅酶自循环系统
1.4.2 多酶组装
1.5 本课题的立题和主要研究内容
1.5.1 立题依据
1.5.2 主要研究内容
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌株及质粒
2.1.2 引物设计
2.1.3 培养基及培养条件
2.1.4 主要实验仪器
2.1.5 主要实验试剂
2.2 实验方法
2.2.1 基因组DNA和相关质粒的提取
2.2.2 目的基因的克隆
2.2.3 重组质粒和重组菌构建
2.2.4 关键酶的纯化及酶活测定
2.2.5 PAKω-TA酶学特性分析
2.2.6 1,2-氨基醇酶催化体系的构建
2.2.7 底物,产物及中间产物浓度测定方法
第三章 结果与讨论
3.1 PAKω-TA功能鉴定及酶学特性分析
3.1.1 PAKω-TA酶基因pakω-ta的克隆表达与酶活测定
3.1.2 PAKω-TA的酶学性质
3.2 多酶级联催化合成1,2-氨基醇体系的构建及验证
3.2.1 SpEH和 Mn ADH的克隆表达及酶活测定
3.2.2 MnADH和 PAKω-TA两酶串联重组菌构建
3.2.3 SpEH、Mn ADH和 PAKω-TA三酶级联催化体系验证
3.3 限速步骤的解除
3.3.1 MnADH和 PAKω-TA的酶量配比优化
3.3.2 MnADH和 PAKω-TA表达量的调节与优化
3.3.3 重组菌转化性能的对比
3.4 辅酶自循环体系的构建及筛选
3.4.1 GluDH的克隆表达及酶活测定
3.4.2 引入GluDH对多酶级联催化反应的影响
3.4.3 人工添加辅酶NADP+和辅底物L-Glu对多酶级联催化反应的影响
3.4.4 AlaDH与 GluDH催化效率比较
3.5 共表达重组菌的构建及全细胞催化合成1,2-氨基醇类化合物
3.5.1 E.coli BL21(SMPG)重组菌构建
3.5.2 E.coli BL21(SGMP)全细胞生物催化合成(S)-2-氨基-1-苯基乙醇
3.5.3 重组菌催化合成其他脂肪族类1,2-氨基醇验证
主要结论与展望
致谢
参考文献
附录 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文
本文编号：3667357
【文章页数】：50 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 1,2-氨基醇类化合物的概述及合成方法
1.1.1 1,2-氨基醇类化合物简介
1.1.2 1,2-氨基醇类化合物的化学合成
1.1.3 1,2-氨基醇类化合物的化学酶法合成
1.1.4 1,2-氨基醇类化合物的生物法合成
1.2 ω-转氨酶
1.2.1 ω-转氨酶简介
1.2.2 ω-转氨酶的研究现状
1.3 环氧化物水解酶,醇脱氢酶和谷氨酸脱氢酶概述
1.3.1 环氧化物水解酶
1.3.2 醇脱氢酶
1.3.3 谷氨酸脱氢酶
1.4 辅酶自循环系统及多酶组装
1.4.1 辅酶自循环系统
1.4.2 多酶组装
1.5 本课题的立题和主要研究内容
1.5.1 立题依据
1.5.2 主要研究内容
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 菌株及质粒
2.1.2 引物设计
2.1.3 培养基及培养条件
2.1.4 主要实验仪器
2.1.5 主要实验试剂
2.2 实验方法
2.2.1 基因组DNA和相关质粒的提取
2.2.2 目的基因的克隆
2.2.3 重组质粒和重组菌构建
2.2.4 关键酶的纯化及酶活测定
2.2.5 PAKω-TA酶学特性分析
2.2.6 1,2-氨基醇酶催化体系的构建
2.2.7 底物,产物及中间产物浓度测定方法
第三章 结果与讨论
3.1 PAKω-TA功能鉴定及酶学特性分析
3.1.1 PAKω-TA酶基因pakω-ta的克隆表达与酶活测定
3.1.2 PAKω-TA的酶学性质
3.2 多酶级联催化合成1,2-氨基醇体系的构建及验证
3.2.1 SpEH和 Mn ADH的克隆表达及酶活测定
3.2.2 MnADH和 PAKω-TA两酶串联重组菌构建
3.2.3 SpEH、Mn ADH和 PAKω-TA三酶级联催化体系验证
3.3 限速步骤的解除
3.3.1 MnADH和 PAKω-TA的酶量配比优化
3.3.2 MnADH和 PAKω-TA表达量的调节与优化
3.3.3 重组菌转化性能的对比
3.4 辅酶自循环体系的构建及筛选
3.4.1 GluDH的克隆表达及酶活测定
3.4.2 引入GluDH对多酶级联催化反应的影响
3.4.3 人工添加辅酶NADP+和辅底物L-Glu对多酶级联催化反应的影响
3.4.4 AlaDH与 GluDH催化效率比较
3.5 共表达重组菌的构建及全细胞催化合成1,2-氨基醇类化合物
3.5.1 E.coli BL21(SMPG)重组菌构建
3.5.2 E.coli BL21(SGMP)全细胞生物催化合成(S)-2-氨基-1-苯基乙醇
3.5.3 重组菌催化合成其他脂肪族类1,2-氨基醇验证
主要结论与展望
致谢
参考文献
附录 :作者在攻读硕士学位期间发表的论文
本文编号：3667357
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/yiyaoxuelunwen/3667357.html
最近更新
教材专著
