转GhBASS5基因拟南芥的敏盐机理研究

发布时间：2020-05-16 06:04

【摘要】：土壤盐渍化是一个世界性的农业问题,严重影响了作物的生产性能。棉花是我国主要的经济作物之一,相较于其他农作物如玉米、小麦、水稻等具有更高的耐盐性。尽管如此,棉花的生长发育和产量还是受到了盐胁迫的严重影响。因此,挖掘棉花耐盐基因,培育耐盐棉花新品种,对于盐碱地的充分开发利用具有重要意义。植物中的钠离子转运体在调控植株中的钠离子积累水平,响应盐胁迫中发挥重要作用。陆地棉GhBASS5基因是Bile acid:Na(胆汁酸/钠)共转运家族基因,编码钠依赖性的酮酸转运体。本课题组在前期研究中发现GhBASS5在响应棉花盐胁迫时下调应答,沉默GhBASS5能降低棉花中的Na~+含量,提高棉花的耐盐性。因此,GhBASS5是否具有促进Na~+向地上部运输的功能是本研究的重点。本研究中使用RT-PCR和qRT-PCR检测GhBASS5的表达水平,结果表明GhBASS5在根中表达量最高且其转录受NaCl诱导下调表达。GhBASS5-GFP的在棉花子叶中的瞬时表达同样证明其定位于叶绿体膜。此外,为进一步研究GhBASS5的耐盐功能。本研究构建了超表达GhBASS5拟南芥材料。使用潮霉素筛选转基因株系,对转GhBASS5基因植株进行PCR检测并利用半定量PCR检测GhBASS5基因的表达水平,筛选出GhBASS5超表达水平较高的两个株系。以转GhBASS5基因拟南芥的T4代纯合植株为实验材料,以野生型拟南芥(WT)作为对照,从盐胁迫下的种子萌发、苗期生理生化指标测定和钠钾离子积累水平考察拟南芥的耐盐性的差异。得到结果如下:1.分别在未添加NaCl和添加NaCl的培养基上点种拟南芥种子,研究发现,在正常生长条件下,转GhBASS5株系与野生型拟南芥的发芽率没有显著差异,而在盐胁迫条件下,转基因株系的发芽率明显低于野生型。2.正常生长条件下,GhBASS5超表达拟南芥与野生型拟南芥相比,其脯氨酸、可溶性糖、MDA、O_2~-含量和SOD酶活性没有显著差异,但H_2O_2含量显著高于野生型。盐胁迫条件下,转基因拟南芥叶片中脯氨酸和可溶性糖含量显著低于野生型,但MDA、O_2~-、H_2O_2含量显著高于野生型。另外,其SOD酶活性也低于野生型,这些结果表明,野生型拟南芥比转基因拟南芥具有更高的耐盐性。3,正常生长条件下,转基因拟南芥地上部积累的钠离子已经显著高于野生型拟南芥。盐胁迫后,转基因和野生拟南芥地上部Na~+均显著升高,但转基因植株叶片中积累的钠离子含量显著高于野生型。进一步研究发现,超表达GhBASS5显著增加了木质部茎流中钠离子的含量。以上结果表明,超表达GhBASS5基因拟南芥的耐盐性低于野生型拟南芥,过表达GhBASS5通过促进Na~+向地上部的运输,增加地上部的Na~+含量,破坏质体功能,进而破坏植物的抗氧化系统等机制增加了转基因拟南芥的敏盐性。
【图文】：

基因,载体,荧光定量PCR,叶绿体膜

M NaCl 处理2 d后GhBASS5基因在棉花叶片，茎和根A：半定量PCR结果；B：荧光定量PCR结果。的亚细胞定位pCAMBIA1300-GhBASS5-eGFP载体，并从中-GFP片段，通过LIC的连接方法将其连接到γ2MV载体注射烟草叶片，生产BSMV病毒，在实现了GhBASS-GFP融合蛋白的表达。使用胞，结果表明，GhBASS5定位于叶绿体膜（果一致。

载体,叶绿体膜,亚细胞定位,萌发期

2.3.2 GhBASS5 的亚细胞定位我们构建了pCAMBIA1300-GhBASS5-eGFP载体，并从中扩增出了带有LIC序列的GhBASS5-GFP片段，通过LIC的连接方法将其连接到γ2载体中（图2.2），使用四系统的BSMV载体注射烟草叶片，生产BSMV病毒，在棉花种子萌发期接种，在棉花幼苗中实现了GhBASS-GFP融合蛋白的表达。使用荧光显微镜观察棉花子叶下表皮细胞，结果表明，GhBASS5定位于叶绿体膜（图2.3），与拟南芥AtBASS5的定位结果一致。图2.2 γ2-GhBASS5-GFP载体的构建A：pCAMBIA1300-GhBASS5-eGFP载体的验证，以构建的pCAMBIA1300-GhBASS5-eGFP载体质粒为模板
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943.2

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