草酸青霉中一种外切-β-1,3-半乳聚糖酶的重组表达及酶学性质研究

发布时间：2020-06-06 01:06

【摘要】：β-半乳聚糖酶是一类以半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖为底物,特异性水解半乳糖残基间糖苷键的糖苷酶,主要包括β-1,3-、β-1,4-和β-1,6-半乳聚糖酶。β-半乳聚糖酶在多糖结构解析、构建药用植物指纹图谱、制备低聚半乳糖和食品品质改良等方面具有广泛应用。其中,β-半乳聚糖酶对于富含β-半乳糖的阿拉伯半乳聚糖等多糖的结构解析至关重要。阿拉伯半乳聚糖是一种具有免疫调节、抗氧化和神经保护等多种生理活性的多糖,具有广阔的应用前景。分析阿拉伯半乳聚糖的精细结构,有利于其构效关系的研究和深度开发应用。本文对一种来源于草酸青霉的外切-β-1,3-半乳聚糖酶进行了重组构建、酶学性质和功能的研究,为阿拉伯半乳聚糖精细结构的研究奠定了基础。论文主要研究结果如下:制备和纯化了重组目的蛋白PoGal3。成功构建了Rosetta-pet32a(+)-pogal3重组大肠杆菌菌株和GS115-pPICZαA-pogal3重组毕赤酵母菌株,在重组毕赤酵母菌株中,外切-β-1,3-半乳聚糖酶PoGal3成功表达。利用硫酸铵沉淀和凝胶过滤层析从400 mL菌液上清中成功纯化出1.2 mg PoGal3。对重组毕赤酵母菌株的诱导培养条件进行优化,确定了BMMY诱导培养基pH为6.0,当菌液OD_(600 nm)达到1.0时开始诱导,甲醇加入量为2.0%(v/v),诱导时间为2 d的诱导培养方案,使蛋白表达量增加到原来的3.3倍。PoGal3由451个氨基酸组成,分子量为48.5 KD,等电点为6.60,是一种稳定性较高的亲水性蛋白。对PoGal3的酶学性质和功能进行了研究。首先,通过高碘酸氧化和Smith降解制备了均一性好、含有少量侧链结构且纯度较高的1,3-β-半乳聚糖AG-P-I。然后,以AG-P-I为底物测得PoGal3f粗酶的比酶活为9.3±0.9 U/mg,PoGal3f纯酶的比酶活为50±3.7U/mg。PoGal3的酶学性质研究结果表明:PoGal3的最适反应温度为40°C,最适pH为5.0,Zn~(2+)的存在可以使PoGal3的酶活增强到原来的128.6%,Li~+、Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(3+)、Hg~(2+)、Mn~(2+)、Ni~+、EDTA和SDS都会使酶活力减弱。底物专一性研究结果表明:PoGal3主要具有β-1,3-半乳聚糖酶活力,也具有一定的β-1,3-葡聚糖酶活力,不能降解1,4/6-β-半乳聚糖、1,4/6-β-葡聚糖、木聚糖和阿拉伯聚糖等。利用PoGal3对AG-P-I以及两种经典的II型阿拉伯半乳聚糖(LWAG和Acacia)进行酶解分析,结果表明,PoGal3能够通过外切作用降解分子量较小的II型阿拉伯半乳聚糖,有潜力成为阿拉伯半乳聚糖结构分析的工具。
【图文】：

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]等从叶下珠中制备了酸性阿拉伯半乳聚糖，，经甲基化分析和 NM乳聚糖为主链，在半乳糖残基的 C3/C6 位和非还原末端检测到木种单糖的存在。来，国内外对于阿拉伯半乳聚糖的分类较为一致。从结构特点出聚糖分为三类，分别命名为 I 型（AGI）、II 型（AGII）和 III 的结构模型如图 1-1，它是以 1,4-β-半乳聚糖为主链，某些半乳被 1,5-Araf，有时也被有糖醛酸，鼠李糖等单糖取代。AGI 通常子和叶片中。AGII 是以 1,3-β-半乳聚糖为主链，伴随有 1f 的支链取代的结构，最常见的两种结构模型来自于阿拉伯树胶半乳聚糖 LWAG，如图 1-2 和 1-3，二者最大的区别在于，前者构相对更复杂。AGII 是最常见的阿拉伯半乳聚糖类型，在松柏渗出液、果实、种子、根以及离体培养的细胞中都能获得，对于多。AGIII 是目前了解较少的一类，其结构模型见图 1-4，是以各拉伯半乳聚糖侧链的一类结构。

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图 1-2 以阿拉伯树胶 Acacia 结构为例的 AGII 结构模型（R 基可能为 t-Rhap、1,3-β-Galp、t-Araf 或 1,3-α-Araf）? 3)Galp(1? 3)Galp(1? 3)Galp(1? 3)Galp(1? 3)Galp(1?6?1Galp6?1Galp6?6?1Araf3?1Arap6?1Galpn?1Araf-3 以落叶松阿拉伯半乳聚糖 LWAG 结构为例的 AGII 结构模
【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q55;Q78

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