新型选择性定位探针介导剪切等温扩增DNA的检测技术研究
发布时间：2020-10-09 09:18
21世纪是生命科学的世纪,核酸作为生命体内基本的遗传物质,在生命活动中起决定性作用,因此对核酸检测技术的创新研究是非常必要的。作为核酸检测技术核心和难点的剪切和扩增技术成为全球性研究热点。核酸特异性剪切主流技术主要有锌指核酸酶(ZFNs),转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN),规律间隔性成簇短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)/CRISPR相关(Cas)蛋白9(CRISPR/Cas9)以及限制性核酸内切酶(REase)。ZFNs和TALEN是基于FokI酶蛋白质介导的DNA(脱氧核糖核酸)特异性剪切技术,需要对每个剪切的序列都设计与其对应的蛋白结构,实验过程复杂;CRISPR/Cas9虽然简化了实验过程,但是它的向导RNA序列较长,在操作过程中可能形成二级结构,对实验产生影响。REase由于其剪切特异性好,方便易得,实验成本较低,较好地弥补上述技术的缺陷而得到广泛应用。继聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)后,发展了大量等温扩增技术,其中指数等温扩增反应(EXPAR)因其模板设计简单,不需要引物等优点备受青睐,但其在扩增长目标序列时会产生较强的非特异性扩增。在进行大量文献分析和研究的基础上,本论文开展了选择性定位探针介导的等温扩增检测方法研究,选择性定位探针与EXPAR联用用于单碱基错配检测研究,基于适配体-磁珠介导选择性定位探针与EXPAR新型检测方法研究,主要创新性研究成果如下:1.发展了 一种选择性定位探针(SPP)介导剪切技术(SPPMC)。其核心技术为设计了一种新型非对称发卡结构的选择性剪切探针,探针结构更稳定,剪切效率更高,具有C碱基选择性结合的识别位点,可以实现对不含REase识别位点的目标序列的单碱基编程任意位点剪切,具有良好的通用性。2.发展了一种SPPMC与EXPAR联用(SPPMC-EXPAR)检测技术。SPPMC剪切目标序列,得到的短序列用于EXPAR反应,可在一定程度上抑制了由于目标序列链长过长引起的非特异性扩增。实验证明SPPMC-EXPAR可以实现对目标序列的短链间接检测,有望实现高灵敏检测。进一步对模板进行硫化优化,使检测灵敏度提高100倍。3.发展了一种基于SPPMC的C碱基错配检测方法。该方法分为SPPMC与EXPAR联用的确证检测方法,最低检测浓度可达10-12M;以及SPPMC与凝胶电泳联用的筛查方法,可检测浓度大于10-7M的目标序列,该方法快速、简便,具有良好的应用前景;4.发展了一种适配体-磁珠介导SPPMC-EXPAR新型检测方法。该方法具有无需样品前处理的高特异性检测目标物识别、复杂体系中目标物快速分离、检测信号自适应放大、高灵敏间接检测等优点。理论上该方法可实现高灵敏的甚至单分子检测。甲基苯丙胺毒品检测证明了该方法的有效性。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q503
【部分图文】：
的高温变性过程，在这个过程中是为了让模板ＤＮＡ解旋成单链，（２）邋５０－６０°Ｃ退火逡逑过程，在此过程中引物和模板ＤＮＡ互补，（３）邋６８－７２邋°Ｃ延伸过程，在此阶段在ＤＮＡ逡逑聚合酶作用下，引物沿着ＤＮＡ模板链发生扩增反应，其反应原理图如图１．１Ｐ］所示。逡逑ＰＣＲ技术具有特异性好，重复性好，可对目标序列实验几百万倍的放大的优点，在逡逑核酸研究领域成为主流的研究方法。在接下来的发展中，人们开发了一系列基本ＰＣＲ逡逑技术的核酸扩增方法ｔ３＿５ｌ大大丰富了核酸的检测手段，扩大了邋ＰＣＲ技术的应用范逡逑围。逡逑尽管ＰＣＲ应用范围广泛，但是自身仍存在缺陷，例如需要精准的控温仪器，这逡逑类仪器往往价格昂贵，这增大了实验成本。另一方面，ＰＣＲ技术中k胃鲅纷疃嘀诲义夏芾┰鲆槐恫铮獯蟠笤黾恿隋澹校茫曳从κ奔洌币彩梗校茫以谑凳奔嗖庵惺艿藉义媳冉洗蟮南拗啤ｅ义舷啾扔冢校茫壹际酰任吕┰鼍弑缸畲蟮挠诺悖褐恍枰桓龊阄禄肪常ū热缢。╁义霞纯煞⑸从
本文编号：2833509
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q503
【部分图文】：
的高温变性过程，在这个过程中是为了让模板ＤＮＡ解旋成单链，（２）邋５０－６０°Ｃ退火逡逑过程，在此过程中引物和模板ＤＮＡ互补，（３）邋６８－７２邋°Ｃ延伸过程，在此阶段在ＤＮＡ逡逑聚合酶作用下，引物沿着ＤＮＡ模板链发生扩增反应，其反应原理图如图１．１Ｐ］所示。逡逑ＰＣＲ技术具有特异性好，重复性好，可对目标序列实验几百万倍的放大的优点，在逡逑核酸研究领域成为主流的研究方法。在接下来的发展中，人们开发了一系列基本ＰＣＲ逡逑技术的核酸扩增方法ｔ３＿５ｌ大大丰富了核酸的检测手段，扩大了邋ＰＣＲ技术的应用范逡逑围。逡逑尽管ＰＣＲ应用范围广泛，但是自身仍存在缺陷，例如需要精准的控温仪器，这逡逑类仪器往往价格昂贵，这增大了实验成本。另一方面，ＰＣＲ技术中k胃鲅纷疃嘀诲义夏芾┰鲆槐恫铮獯蟠笤黾恿隋澹校茫曳从κ奔洌币彩梗校茫以谑凳奔嗖庵惺艿藉义媳冉洗蟮南拗啤ｅ义舷啾扔冢校茫壹际酰任吕┰鼍弑缸畲蟮挠诺悖褐恍枰桓龊阄禄肪常ū热缢。╁义霞纯煞⑸从
本文编号：2833509
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