KCNQ通道的h Navβ1-Tenascins分子组合调控研究

发布时间：2020-10-09 17:09

　　钾离子(K+)通道控制钾离子流出和流入细胞的运输,可分为电压门控钾通道(Kv)、内向整流钾通道(Kir)、钙激活钾通道(KCa)和双孔钾通道(K2p)四类。电压门控钾通道,有78个成员,由约40个基因组成的大家族,分为12个亚家族(Kv 1-Kv 12)。Kv 7家族,又称KCNQ家族,包含5个α亚基,Kv 7.1-7.5,由基因KCNQ 1-5编码,在不同的组织中具有功能差异性表达,是具有吸引力的药物靶点。Navβ亚基(Navβ1-Navβ4)是多功能I型跨膜蛋白,调节Navα亚基的门控,定位和转运。Navβ1亚基也被证实可以调节部分Kv通道的功能,但其亚型选择性及分子互作机制不明,Navβ1亚基对KCNQ通道功能调节更鲜有报道。细胞外基质(ECM)是一种三维大分子网络,由结构蛋白,粘连蛋白和一些蛋白聚糖够成。Tenascins是Tenascin-C(TNC)、Tenascin-R(TNR)等6个成员组成的一组细胞外基质糖蛋白,其中TNC、TNR在细胞增殖和迁移、轴突病理发现、髓鞘化、突触可塑性等方面发挥重要作用。KCNQ钾通道与胞外基质(TNC、TNR)在细胞增殖、分化和存活中都具有重要生理作用,那么细胞膜上KCNQ钾通道功能是否会受到胞外基质TNC/TNR影响?目前关于胞外基质调控钾通道的文献,鲜有报道。因此,本论文旨在探明KCNQ钾通道、h Navβ1亚基以及胞外基质(TNC、TNR)的分子互作组合调控机制,以期为临床相关疾病的预防和及新型KCNQ通道靶向治疗提供新的策略。本论文通过HEK 293 T细胞特异性转染KCNQ 1、KCNQ 2、KCNQ 3、KCNQ4,共同转染KCNQ 1+h Navβ1、KCNQ 2+h Navβ1、KCNQ 3+h Navβ1、KCNQ4+h Navβ1以及转染后孵育TNC/TNR,利用全细胞膜片钳技术深入研究KCNQ+h Navβ1、KCNQ-TNC/TNR、KCNQ+h Navβ1-TNC/TNR的电流表达变化,探究KCNQ钾通道、h Navβ1亚基以及TNC/TNR的相关分子互作组合调控机制。主要结果如下:KCNQ通道门控动力学的研究,对明确KCNQ通道的电生理特性以及研究h Navβ1亚基与胞外基质(TNC、TNR)对KCNQ通道的作用提供参考。在全细胞膜片钳模式下,分别记录HEK 293T细胞转染KCNQ 1、KCNQ 2、KCNQ 3、KCNQ4的电流,分析峰值电流、I-V曲线、Id曲线。结果显示:KCNQ 1峰值电流约为400±50 p A,电流密度约为70±5 p A/p F;KCNQ 2峰值电流约为350±50 p A,电流密度约为20±5 p A/p F;KCNQ 3峰值电约为600±50 p A,电流密度约为20±5 p A/p F;KCNQ 4峰值电流约为550±50 p A,电流密度约为15±5 p A/p F。2.KCNQ通道与h Navβ1亚基的分子互作在全细胞膜片钳模式下,记录了HEK 293T细胞中分别共转KCNQ 1+h Navβ1、KCNQ 2+h Navβ1、KCNQ 3+h Navβ1和KCNQ 4+h Navβ1的电流,分析峰值电流、I-V曲线、Id曲线。结果显示:h Navβ1显著增大了KCNQ 1的峰值电流,对KCNQ2、KCNQ 3、KCNQ 4的峰值电流无显著影响。此外,h Navβ1显著减小了KCNQ 1、KCNQ 2的电流密度,显著增大了KCNQ 3、KCNQ 4的电流密度,表明h Navβ1亚基与KCNQ通道组合,可以差异性调控KCNQ通道的门控特性。3.胞外基质(TNC/TNR)对KCNQ通道的调制在全细胞膜片钳模式下,分别记录HEK 293T细胞转染KCNQ 1、KCNQ 2、KCNQ 3、KCNQ 4后,孵育TNC或TNR的电流,分析峰值电流、I-V曲线、Id曲线。结果显示:TNC显著增强了KCNQ 2的峰值电流,显著抑制了KCNQ 3、KCNQ4的峰值电流,而对KCNQ 1的峰值电流无影响;TNR显著增大了KCNQ 1、KCNQ2、KCNQ 4的峰值电流,显著减小了KCNQ 3的峰值电流。TNC显著减小了KCNQ1、KCNQ 3的电流密度,显著增大了KCNQ 2,对KCNQ 4的电流密度无显著影响;TNR显著减小了KCNQ 1、KCNQ 3的电流密度,增大了KCNQ 2的电流密度,对KCNQ 4的电流密度几乎无影响。结果表明,TNC/TNR可以差异调节KCNQ钾通道的电生理特性。4.胞外基质(TNC/TNR)对KCNQ通道与Navβ1亚基组合的调控作用在全细胞膜片钳模式下,分别记录HEK 293T细胞共转KCNQ 1、KCNQ 2、KCNQ 3、KCNQ 4与h Navβ1亚基后,孵育TNC/TNR的电流,得到KCNQ1+h Navβ1-TNC/TNR、KCNQ 2+h Navβ1-TNC/TNR、KCNQ 3+h Navβ1-TNC/TNR、1.KCNQ通道的门控动力学KCNQ 4+h Navβ1-TNC/TNR的峰值电流、I-V曲线、Id曲线。结果显示:TNC显著增大了KCNQ 1+h Navβ1、KCNQ 2+h Navβ1、KCNQ 4+h Navβ1的峰值电流,对KCNQ3+h Navβ1的峰值电流无明显影响;TNR显著抑制了KCNQ 1+h Navβ1、KCNQ3+h Navβ1的峰值电流,显著增强了KCNQ 2+h Navβ1的峰值电流,对KCNQ4+h Navβ1的峰值电流几乎无影响。TNC对KCNQ1+h Navβ1的电流密度几乎无影响,显著增大了KCNQ 2+h Navβ1的电流密度,减小了KCNQ 3+h Navβ1、KCNQ4+h Navβ1的电流密度;TNR显著增大了KCNQ 2+h Navβ1、KCNQ 4+h Navβ1的电流密度;显著减小了KCNQ 1+h Navβ1、KCNQ 3+h Navβ1电流密度,表明TNC/TN R与KCNQ钾通道、h Navβ1亚基互作组合调控,影响钾通道的门控特性。结论:h Navβ1亚基、TNC/TNR可以差异性调节KCNQ 1、KCNQ 2、KCNQ 3、KCNQ 4的电流。TNC/TNR可以差异性调节KCNQ 1+h Navβ1、KCNQ 2+h Navβ1、KCNQ 3+h Navβ1、KCNQ 4+h Navβ1的电流。因此,明确KCNQ通道、h Navβ1亚基以及Tenascins之间的分子互作组合调控机制,有助于为解析钾通道的差异性功能表达和靶向药物筛制提供新思路。
【学位单位】：延安大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q25
【部分图文】：

电压门控,钾离子通道,电压,钾通道

第一章绪论最大贡献者[25]。Kv 通道从功能上分为 A 型瞬时外向钾通道、延迟外、介导 M 电流的外向整流钾通道和超速激活的延迟整流钾通道[26]。外向整流钾通道是由KCNQ通道亚基同源物或源自KCNQ 1-5基因成成[27]。压门控钾通道（Kv）是由α功能性亚基和β辅助亚基构成的复合蛋白。-DIV 四个同源跨膜结构域构成，每个结构域有六次跨膜螺旋，细胞内，电压感受在于 S4 氨基酸残基带正电荷的，S 4-S 5 与 Kv 通道的开相关。N 端糖基化位点在细胞外，cATP 磷酸化位点在细胞内。S 6 螺Kv 通道的电压敏感型起重要作用，因为 S 6 螺旋处 Pro-Val-Pro（PVP用，如图 1[28]。

电流特性

KCNQ 通道的 hNavβ1-Tenascins 分子组合调控研究第三章研究结果3.1 KCNQ 通道的门控动力学3.1.1 KCNQ 1 电流特性HEK 293T 细胞转染 KCNQ 1，24 h 后记录 KCNQ 1 通道电流。在全细胞膜片钳模式下，采用图 3-1 KCNQ 通道的刺激程序，将细胞膜电压钳制于-80 mV，以 10mV 的增量从-80 mV 步阶进至+30 mV，持续时间为 200 ms，诱导出 KCNQ 1 通道电流。图 3-1-1 A 表示每个阶跃测试电压刺激下的 KCNQ 1 通道电流原始轨迹图，图 3-1-1 B 表示 KCNQ 1 的 I-V 曲线图，电流幅度约为 400±50 pA，所做细胞个数n=6；图 3-1-1 C 表示 KCNQ 1 通道的 Id 曲线图，电流密度约为 70±5 pA/pF。

电流特性

图 3-1-2 KCNQ 2 电流特性Fig. 3-1-2 Electrophysiological characteristics of KCNQ 2图 3-1-2A 为 KCNQ 2 通道电流原始轨迹图；B 为以测试电压 V(mV)为横坐标，电流 I(pA)为纵坐标，KCNQ2 通道的 I-V 曲线图；C 为以测试 V(mV)为横坐标，电流密度 Id(pA/pF)为纵坐标的 Id 曲线图；所有数据展示均采用 Mean±SEM。3.1.3 KCNQ 3 电流特性HEK 293T 细胞转染 KCNQ 3，24 h 后记录 KCNQ 3 电流。在全细胞膜片钳模式下，采用图 3-1 KCNQ 通道的刺激程序，将细胞膜电压钳制于-80 mV，以 10 mV的增量从-80 mV 步阶进至+30 mV，持续时间为 200 ms，诱导出 KCNQ 3 通道电流。图 3-1-3A 表示正常情况下，每个阶跃刺激的 KCNQ 3 通道原始电流轨迹图，图 3-1-3B 表示正常情况下，KCNQ 3 通道的 I-V 曲线图，电流幅度约为 600±50 pA，所做细胞个数 n=6，激活电压约为-80 mV；图 3-1-3 C 表示正常情况下，KCNQ 3 通道的Id 曲线图，电流密度约为 20 pA/pF。

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