生物矿化法固定化酶的研究

发布时间：2020-10-10 20:28

　　 在现有的催化类型中,使用酶催化是一种既绿色环保,又方便快捷的方式。然而,造价昂贵、制备工艺复杂、不能循环使用等缺点成为了制约酶在工业生产中的不利因素。因此,通过将酶固定在特定载体上的方式,在保证了酶能够重复利用的同时,又能在一定程度上提高酶的稳定性。而生物矿化(Biomineralization)是一种新兴的大分子固定化方式,与传统的固定化方式不同,生物矿化法通过将蛋白、氨基酸等有机成分与无机盐(磷酸盐等)用共沉淀的方法连接在一起,从而制备出复杂的形状、分层的组织、均匀的颗粒尺寸,并通常具有强度高等显著性能。科学家们通过尝试模仿生物体内结晶过程,结合现代复合材料和控制矿物结晶技术,探索出了以无机盐为骨架,层层堆叠生物大分子的方式,制备出了具有花型结构的纳米颗粒--纳米花(Nano-flower)。本研究主要分为两个部分,第一部分是用磷酸锌(Zn_3(PO_4)_2)作为载体实现脂肪酶(CSL)的固定化,并且详细研究了CSL浓度、制备时间、温度、离子强度及所固定的生物大分子种类对该纳米颗粒形状和大小的影响。确定了制备纳米花的最适条件为:将硫酸锌溶液(80 mg/mL,5 mL)滴加入CSL溶液(0.6 mg/mL,100 mL)中,在室温(约20℃)条件下搅拌1小时,静置温育2小时后,所得到的为最佳状态纳米花。通过EDAX、扫描电镜、透射电镜、傅里叶红外、XRD晶体衍射、元素分析方式对纳米花进行了性质表征,初步确认了我们制备的纳米花中既含有Zn_3(PO_4)_2成分,又含有CSL酰胺键及N元素,证明了CSL确实被固定在了载体上,并且通过计算发现纳米花中的CSL含量约为7.2%。接下来,将制备好的纳米花用于催化熊果苷乙酰化,发现在添加的酶量相同时,纳米花的催化活力(15.9±0.5 U)约为游离酶CSL(3.7±0.2 U)的4.3倍,同时热稳定性也有很大提高。将纳米花重复使用10次后,仍能保持约95%的活力;在储存20天后,保留约92%的活力,可见固定化之后的CSL稳定性很高。在研究了CSL-Zn_3(PO_4)_2纳米花的制备及催化之后,我们不禁想到,如果能找到一种金属依赖性酶,那么将酶与这种金属结合后,在达到常规固定化的效果的同时,又能够极大地提高酶活。因此本次研究的第二部分中,我们选择D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(DPEase)作为研究对象。通过将其表达纯化后,DPEase的纯度达到90%以上,分子量约为40 kDa。我们研究了游离DPEase的各种理化性质,发现DPEase是Co~(2+)、Mn~(2+)依赖型酶,在添加100μM的Co~(2+)时酶活达到最大;最适pH为8.0,最适温度为60℃。然而DPEase的热稳定性和pH稳定性较差,为了解决DPEase在加热条件下易失活的问题,我们想到了将其用生物矿化的方法固定在载体上。鉴于DPEase是Co~(2+)依赖型酶,我们使用磷酸钴作为无机载体,既能够实现固定化后提高DPEase的稳定性,又能够通过Co~(2+)对DPEase的激活作用,更进一步提高酶活力。这也是第一次通过生物矿化法实现DPEase在含Co~(2+)的纳米载体上的固定化。通过对制备DPEase-Co_3(PO_4)_2的过程以及相关影响因素的深入研究,我们得出了结论:将2mg DPEase与磷酸盐(pH 7.4,50.0 mM)混合,加入10.0μl CoSO_4(1.0 M),置于4℃条件下搅拌48h,所得沉淀即为最佳状态纳米花。通过对纳米花进行扫描电镜检测、EDAX检测、傅里叶红外检测、元素分析,初步鉴定了纳米花中含有酰胺I和酰胺II带(DPEase),以及Co、P元素(Co_3(PO_4)_2);通过计算发现纳米花中固定的DPEase含量约为12%。在酶学研究上,纳米花的催化活力(36.2±0.5 U/mg)约是游离酶(5.0±0.2 U/mg)的7.2倍。对于酶活的显著提高,我们进行了详细分析:由于DPEase是一种严格的Co~(2+)依赖性酶,在纳米花的形成中,Co~(2+)可以结合DPEase的特定功能位点,并通过变构效应(Allosteric Effect)激活DPEase。此外,在固定化过程中,Co~(2+)和DPEase被挤压在有限的空间,Co~(2+)非常靠近DPEase,大多数活性形式的DPEase可以在固定过程中被富集或―锁定‖,从而轻松激活DPEase。这可能是DPEase-Co~(2+)纳米花显著提高酶活性的合理解释。在本次研究中,我们使用了生物矿化方法,成功地制备出CSL-Zn_3(PO_4)_2与DPEase-Co_3(PO_4)_2纳米花。该新方法将载体的制备和酶的固定化完美结合,大大简化了固定化过程。此外,这种生物矿化方法可以在固定过程中显著提高酶活及酶的稳定性,这表明这种新的生物矿化方法对于酶(尤其是自身能够被某种金属离子激活的酶)的固定化,有着很深远的意义。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q814.2
【部分图文】：

图 1.2 各种形态的纳米花[106]Figure 1.2 Different shapes of nanoflowers1.5 本论文的研究目的和意义在目前的催化反应领域中，酶法催化是公认的快捷、高效且绿色环保的方式。而通常商品酶造价昂贵，实验室纯化的过程又比较复杂，因此我们需要高效地利用这些酶，将有限的酶价值最大化。节约成本的方式主要有一下几个：提高酶活力；增强酶稳定性；重复使用。那么如何能够达到这三点要求是我们本次研究的立题依据。基于这三点要求，我们想到了将酶固定化。传统的固定化方式有许多优点，但劣势也同样突出，比如：通过物理法将酶与载体结合后，结合不牢固而脱落的现象比较明显；而采用化学法将酶固定化后，所用的交联剂等会使酶的结构发生改变，因而降低酶活。这个时候，一种全新的固定化酶方式进入了我们的视野：

图 2.1. 不同 BSA 浓度所制备的 BSA-Cu3(PO4)2纳米花[106]Figure 1. BSA-Cu3(PO4)2nanoflowers with different concentrations of BSA通过改变加酶量及反应条件等来调节纳米花的大小、形状也同时成为了制备纳米材料的一项新挑战。经过几年的摸索，目前已经合成了多种形状及尺寸的纳米材料。早在 2007 年，Tongming Shang 等人利用硫酸锌与氢氧化钠高温混合，并加入适量 L-抗坏血酸，成功制备出了花状，盘状等形状的纳米结构的氧化锌材料[134]。纳米大小 ZnO 作为半导体材料，容易在任何类型的基材上生长，例如单一基材水晶、玻璃、塑料、聚合物等，价格低廉和广泛的生物相容性，多被应用于传感器、电极、压敏电阻等领域[135-137]。

图 2.1. 不同 BSA 浓度所制备的 BSA-Cu3(PO4)2纳米花[106]Figure 1. BSA-Cu3(PO4)2nanoflowers with different concentrations of BSA通过改变加酶量及反应条件等来调节纳米花的大小、形状也同时成为了制备材料的一项新挑战。经过几年的摸索，目前已经合成了多种形状及尺寸的纳料。早在 2007 年，Tongming Shang 等人利用硫酸锌与氢氧化钠高温混合，入适量 L-抗坏血酸，成功制备出了花状，盘状等形状的纳米结构的氧化锌[134]。纳米大小 ZnO 作为半导体材料，容易在任何类型的基材上生长，例如基材水晶、玻璃、塑料、聚合物等，价格低廉和广泛的生物相容性，多被应传感器、电极、压敏电阻等领域[135-137]。
【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 唐睿康;;亚洲生物矿化前沿问题[J];国际学术动态;2010年03期

2 邹良慧;;生物矿化在环境保护方面的应用[J];今日财富;2019年13期

3 岩石;;生物矿化研究的新平台——第九届生物矿化国际研讨会简介[J];地球化学;2006年02期

4 黄磊;杨永强;李金洪;;生物矿化研究现状和展望[J];地质与资源;2009年04期

5 郭章伟;郭娜;刘涛;尹衍升;;微生物抑制腐蚀机理及生物矿化机理研究进展[J];表面技术;2018年02期

6 赵丽娜;王悦;刘冬雪;陈璐;冯晓旭;;模拟生物矿化制备球形碳酸钙粒子及表征[J];化学工程师;2012年09期

7 唐志华;生物矿化及其形成机制[J];生物学杂志;1995年04期

8 查尔斯·崔;裴淑娟;;生物矿化源于海水的碱化?[J];飞碟探索;2017年11期

9 田力丽;程振江;肖诚;;生物矿化在牙体硬组织修复中的应用[J];生物骨科材料与临床研究;2009年02期

10 吴雨薇;胡俊;张皖湘;汪树成;刘文博;;微生物矿化技术加固土研究现状综述[J];路基工程;2018年05期

相关博士学位论文 前10条

1 郑璐;生物矿化法固定化酶的研究[D];吉林大学;2019年

2 姚奇志;多级微纳米结构碳酸盐矿物合成与组装及其生物矿化意义[D];中国科学技术大学;2019年

3 房江育;水稻中纳米硅的生物矿化及硅的细胞学作用[D];甘肃农业大学;2003年

4 李全利;壳聚糖磷酸化改性仿生构建骨再生材料[D];四川大学;2005年

5 周灵德;钙磷降解材料生物矿化的细胞分子生物学基础研究[D];武汉理工大学;2006年

6 穆亚冰;仿生矿化及其因素的调控研究[D];吉林大学;2008年

7 史家远;不同形貌无定形二氧化硅的可控合成及其生物矿化意义[D];中国科学技术大学;2013年

8 张蕾;生物粘合与生物矿化启发下多酶催化系统的构建[D];天津大学;2010年

9 杨宇玲;基于生物矿化提高蛋白质稳定性的研究[D];浙江大学;2016年

10 王广川;基于生物矿化提高生物耐热性的新策略[D];浙江大学;2013年

相关硕士学位论文 前10条

1 句颖;碳酸盐矿化菌的运动行为及生物矿化研究[D];天津大学;2018年

2 方超林;胶凝及土基建筑材料中的微生物方解石沉淀研究：简便易行、经济节约及真菌介导[D];华东师范大学;2019年

3 黄建璋;微生物矿化修复铜、铅污染土的效果及稳定性研究[D];扬州大学;2018年

4 张舒昀;自愈合多糖水凝胶的制备、矿化及用于牙缺损修复的研究[D];暨南大学;2018年

5 吴洋;基于巴氏芽孢八叠球菌的生物矿化现象及分子机理的研究[D];天津大学;2017年

6 常芙嘉;仿生制备氧化铁纳米颗粒及其电催化性能的研究[D];中国科学技术大学;2018年

7 冷晓轩;生物矿化对SiO_2和Fe_2O_3结构和性能影响的研究[D];武汉理工大学;2015年

8 李阳;两种方法处理后钛合金表面的生物矿化及其性能研究[D];兰州大学;2012年

9 祝春水;生物矿化针铁矿处理含铬废水及其机理研究[D];武汉理工大学;2004年

10 马长松;一种生物矿化的硫化钴纳米探针用于肿瘤的光声成像与光热治疗研究[D];苏州大学;2016年

本文编号：2835545