应用CRISPR/Cas9技术在植物乳杆菌中进行基因编辑的研究
发布时间：2020-12-10 14:10
乳酸菌是一类与人的身体健康密切相连的微生物。随着完成全基因组测序的乳酸菌种类越来越多,功能性基因的研究也越来越重要。CRISPR/Cas9基因编辑技术由于实验简单、操作容易、节省时间等优势,可以精确、高效地对基因组进行敲除或者修饰,已经在不同物种中迅速发展起来并得到广泛应用,但是在乳酸菌中的研究报道不多。葡糖胺-6-磷酸合成酶（Glucosamine-6-phosphate synthase,GlmS）是氨基已糖代谢途径（HBP）的催化酶,终产物是N-乙酰-D-葡糖胺（GlcNAc）和氨基葡萄糖（GlcN）。本实验室前期研究表明glmS1基因是植物乳杆菌WCFS1编码GlmS的重要基因,glmS1基因缺陷菌在不添加氨基葡糖的培养基中无法生长。本研究将选用glmS1基因作为CRISPR/Cas9基因编辑技术的目的基因,构建并验证植物乳杆菌WCFS1基因编辑系统,为进一步开展更多乳酸菌的功能基因的编辑奠定基础。本研究首先分别成功构建了含Cas9、recT基因的pMT019和含tracrRNA的ptracrRNA两种质粒。随后通过对启动子结构进行优化,确定了含诱导型启动子PSPPQ的pMT0...
【文章来源】：南京师范大学江苏省 211工程院校
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．２三种ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系统的Ｃａｓ蛋白??－
般长度为几个碱基，与原间隔序列紧邻。一般情况下ＰＡＭ序列为ＮＧＧ。在适应阶段，??细菌对首次入侵的外源ＤＮＡ进行识别，寻找潜在ＰＡＭ序列以确定原间隔序列，其??次将其整合到ＣＲＩＳＰＲ的两个相邻的重复序列之间，形成间隔序列（图１．３）。因此，??可以通过间隔序列的位置来判断细菌整合外源基因的时间先后［７９】。值得注意的是，在??适应阶段Ｃａｓｌ和Ｃａｓ２两种核酸酶都是不可缺少的，有研宄表明，将细菌Ｃｏｓ７和??Ｃｍ２两个基因中的任意一个敲除后细菌都无法获得间隔序列＠］。??在表达阶段，当己被宿主获得间隔序列的外源ＤＮＡ再次进入宿主菌时，ＣＲＩＳＰＲ??的表达被诱导上调…１，从而激发宿主菌的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统发挥免疫作用［８２］，其中??间隔序列和重复序列被转录成前体ＲＮＡ?（Ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ），最后Ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ被剪切加工??形成成熟的ｃｒＲＮＡ，成熟的ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ与Ｃａｓ９蛋白形成核糖核蛋白复合物［８３］??（图?１．４）。??在干扰阶段，表达阶段形成的核糖核蛋白复合物识别外源ＤＮＡ并与之结合，对??外源ＤＮＡ的特定位点进行切割
ｍｍ?剪切??图１．４ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９的表达阶段??Ｆｉｇｌ．４?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９?ｓｙｓｔｅｍ?ｉｎ?ｂａｃｔｅｒｉａ??第三阶段：靶向干抗?〇??扫描耙点ｇ歹！ｉ?（?３?ｔｒａｃｒＲＮＡ??＾ｍｍ?Ｃａｓ９?１?［???ｒｎ＾ｍ???ｃｒＲＮＡ???－－■■■－■－?－???????双链外源ＤＮＡ?ＰＡＭ?Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ??ｊ?靶点序列配对??ｔｒａｃｒＲＮＡ－－ｈ．??ｆ?＼?Ｃａｓ９???ｐａｍ／?、?＾??氺????ｙ＂?一＾?木??外源ＤＮＡ双链被剪开??ｃｒＲＮＡ??图１．５?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９的干扰阶段??Ｆｉｇｌ．５?Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＣＲＩＳＰＲ７Ｃａｓ９?ｓｙｓｔｅｍ?ｉｎ?ｂａｃｔｅｒｉａ??１．３．５?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统研究进展??２０１２年，Ｊｉａｎｇ?Ｗ等人＿将ＣＲ１ＳＰＲ／Ｃａｓ９系统中ｃｒＲＮＡ和ｔｒａｃｒＲＮＡ两个非编??码ＲＮＡ改造成一个ＲＮＡ，即单导向ＲＮＡ?（Ｓｉｎｇｌｅ－ｇｕｉｄｅ?ＲＮＡ，?ｓｇＲＮＡ），它能够指导??Ｃａｓ９蛋白对特定的ＤＮＡ序列进行靶向断裂，为ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ
【参考文献】：
期刊论文
[1]糖尿病患者肠道菌群研究[J]. 张弘超,金英朝,李成镇,刘大伟. 糖尿病新世界. 2016(15)
[2]植物乳杆菌L01对高脂血症大鼠的降胆固醇功效[J]. 张健,黄翠姬,刘昭明,吴凡. 食品科技. 2016(04)
[3]乳酸菌基因敲除技术的研究进展[J]. 杜胜阳,王斌斌,冯佳,侯斌晓,乔建军. 食品与发酵工业. 2016(01)
[4]CRISPR/Cas9系统在基因组DNA片段编辑中的应用[J]. 李金环,寿佳,吴强. 遗传. 2015(10)
[5]基因组编辑:植物生物技术的机遇与挑战[J]. 程曦,王文义,邱金龙. 生物技术通报. 2015(04)
[6]婴幼儿肠道微生物的定植特征[J]. 范文广,王婷婷,霍贵成. 食品工业科技. 2014(06)
[7]灵芝lz-8基因乳酸菌表达载体的构建与表达及免疫特性[J]. 曲宁宁,陈萍,孙鑫泽,张雪,刘琼. 吉林农业大学学报. 2013(04)
[8]乳酸乳球菌同源整合载体的构建及鉴定[J]. 秦艳青,金宁一,李昌,任大勇,沈明浩. 吉林农业大学学报. 2012(06)
[9]低乳糖奶的研究进展及应用[J]. 孙东跃,陈历俊. 中国食品添加剂. 2012(04)
[10]分子标记技术应用于乳酸菌分类鉴定的研究进展[J]. 刘斌,黄少磊,刘彦民,龚虹. 中国微生态学杂志. 2012(07)
博士论文
[1]源于嗜热链球菌的真核CRISPR/Cas9系统的建立、优化及其应用研究[D]. 徐坤.西北农林科技大学 2015
[2]利用CRISPR/Cas9进行基因编辑[D]. 沈彬.南京大学 2014
[3]代谢工程改造大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖及过程优化与控制[D]. 陈欣.江南大学 2012
硕士论文
[1]山羊CRISPR/Cas9基因编辑系统优化的研究[D]. 黄玉.西北农林科技大学 2018
[2]寡核苷酸重组工程和CRISPR-Cas9联合运用于大肠杆菌基因组编辑[D]. 孙尖.南京师范大学 2018
[3]小球藻CRISPR/Cas9基因编辑流程的建立和优化[D]. 潘文欢.华南理工大学 2016
[4]广西巴马长寿地区不同年龄人群肠道菌群分析[D]. 郭飞翔.扬州大学 2015
[5]大肠杆菌pheA和tyrA基因敲除菌的构建[D]. 蒋婕.吉林大学 2013
本文编号：2908826
【文章来源】：南京师范大学江苏省 211工程院校
【文章页数】：81 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．２三种ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系统的Ｃａｓ蛋白??－
般长度为几个碱基，与原间隔序列紧邻。一般情况下ＰＡＭ序列为ＮＧＧ。在适应阶段，??细菌对首次入侵的外源ＤＮＡ进行识别，寻找潜在ＰＡＭ序列以确定原间隔序列，其??次将其整合到ＣＲＩＳＰＲ的两个相邻的重复序列之间，形成间隔序列（图１．３）。因此，??可以通过间隔序列的位置来判断细菌整合外源基因的时间先后［７９】。值得注意的是，在??适应阶段Ｃａｓｌ和Ｃａｓ２两种核酸酶都是不可缺少的，有研宄表明，将细菌Ｃｏｓ７和??Ｃｍ２两个基因中的任意一个敲除后细菌都无法获得间隔序列＠］。??在表达阶段，当己被宿主获得间隔序列的外源ＤＮＡ再次进入宿主菌时，ＣＲＩＳＰＲ??的表达被诱导上调…１，从而激发宿主菌的ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统发挥免疫作用［８２］，其中??间隔序列和重复序列被转录成前体ＲＮＡ?（Ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ），最后Ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ被剪切加工??形成成熟的ｃｒＲＮＡ，成熟的ｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ与Ｃａｓ９蛋白形成核糖核蛋白复合物［８３］??（图?１．４）。??在干扰阶段，表达阶段形成的核糖核蛋白复合物识别外源ＤＮＡ并与之结合，对??外源ＤＮＡ的特定位点进行切割
ｍｍ?剪切??图１．４ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９的表达阶段??Ｆｉｇｌ．４?Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９?ｓｙｓｔｅｍ?ｉｎ?ｂａｃｔｅｒｉａ??第三阶段：靶向干抗?〇??扫描耙点ｇ歹！ｉ?（?３?ｔｒａｃｒＲＮＡ??＾ｍｍ?Ｃａｓ９?１?［???ｒｎ＾ｍ???ｃｒＲＮＡ???－－■■■－■－?－???????双链外源ＤＮＡ?ＰＡＭ?Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ??ｊ?靶点序列配对??ｔｒａｃｒＲＮＡ－－ｈ．??ｆ?＼?Ｃａｓ９???ｐａｍ／?、?＾??氺????ｙ＂?一＾?木??外源ＤＮＡ双链被剪开??ｃｒＲＮＡ??图１．５?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９的干扰阶段??Ｆｉｇｌ．５?Ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＣＲＩＳＰＲ７Ｃａｓ９?ｓｙｓｔｅｍ?ｉｎ?ｂａｃｔｅｒｉａ??１．３．５?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系统研究进展??２０１２年，Ｊｉａｎｇ?Ｗ等人＿将ＣＲ１ＳＰＲ／Ｃａｓ９系统中ｃｒＲＮＡ和ｔｒａｃｒＲＮＡ两个非编??码ＲＮＡ改造成一个ＲＮＡ，即单导向ＲＮＡ?（Ｓｉｎｇｌｅ－ｇｕｉｄｅ?ＲＮＡ，?ｓｇＲＮＡ），它能够指导??Ｃａｓ９蛋白对特定的ＤＮＡ序列进行靶向断裂，为ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａ
【参考文献】：
期刊论文
[1]糖尿病患者肠道菌群研究[J]. 张弘超,金英朝,李成镇,刘大伟. 糖尿病新世界. 2016(15)
[2]植物乳杆菌L01对高脂血症大鼠的降胆固醇功效[J]. 张健,黄翠姬,刘昭明,吴凡. 食品科技. 2016(04)
[3]乳酸菌基因敲除技术的研究进展[J]. 杜胜阳,王斌斌,冯佳,侯斌晓,乔建军. 食品与发酵工业. 2016(01)
[4]CRISPR/Cas9系统在基因组DNA片段编辑中的应用[J]. 李金环,寿佳,吴强. 遗传. 2015(10)
[5]基因组编辑:植物生物技术的机遇与挑战[J]. 程曦,王文义,邱金龙. 生物技术通报. 2015(04)
[6]婴幼儿肠道微生物的定植特征[J]. 范文广,王婷婷,霍贵成. 食品工业科技. 2014(06)
[7]灵芝lz-8基因乳酸菌表达载体的构建与表达及免疫特性[J]. 曲宁宁,陈萍,孙鑫泽,张雪,刘琼. 吉林农业大学学报. 2013(04)
[8]乳酸乳球菌同源整合载体的构建及鉴定[J]. 秦艳青,金宁一,李昌,任大勇,沈明浩. 吉林农业大学学报. 2012(06)
[9]低乳糖奶的研究进展及应用[J]. 孙东跃,陈历俊. 中国食品添加剂. 2012(04)
[10]分子标记技术应用于乳酸菌分类鉴定的研究进展[J]. 刘斌,黄少磊,刘彦民,龚虹. 中国微生态学杂志. 2012(07)
博士论文
[1]源于嗜热链球菌的真核CRISPR/Cas9系统的建立、优化及其应用研究[D]. 徐坤.西北农林科技大学 2015
[2]利用CRISPR/Cas9进行基因编辑[D]. 沈彬.南京大学 2014
[3]代谢工程改造大肠杆菌发酵生产氨基葡萄糖及过程优化与控制[D]. 陈欣.江南大学 2012
硕士论文
[1]山羊CRISPR/Cas9基因编辑系统优化的研究[D]. 黄玉.西北农林科技大学 2018
[2]寡核苷酸重组工程和CRISPR-Cas9联合运用于大肠杆菌基因组编辑[D]. 孙尖.南京师范大学 2018
[3]小球藻CRISPR/Cas9基因编辑流程的建立和优化[D]. 潘文欢.华南理工大学 2016
[4]广西巴马长寿地区不同年龄人群肠道菌群分析[D]. 郭飞翔.扬州大学 2015
[5]大肠杆菌pheA和tyrA基因敲除菌的构建[D]. 蒋婕.吉林大学 2013
本文编号：2908826
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