基于原噬菌体重组酶的乳酸菌基因组编辑技术的建立及其应用
发布时间：2021-01-14 23:56
乳酸菌应用于食品发酵领域具有悠久历史,它产生有机酸、维生素、多糖等高附加值化合物,赋予产品特殊的风味、质地和保质期。最近发现,一些乳酸菌也对人体有益生作用。干酪乳杆菌作为乳酸菌,是一种重要的工业微生物,广泛应用于乳制品发酵领域。目前,基因组测序技术及功能基因组学的发展为干酪乳杆菌中假想蛋白的功能鉴定,代谢工程改造,合成生物学的发展提供了理论基础。然而,干酪乳杆菌的基因组编辑主要采用同源双交换的方法,这种方法效率低下,耗时且操作烦琐,阻碍了上述课题的研究进程。此外,干酪乳杆菌也可以作为理想的细胞工厂表达抗原,生物活性分子以及一些酶类。但是,干酪乳杆菌作为细胞工厂还存在很多亟需解决的问题,例如,无法实现高效地程序化精简基因组,以便构建最适细胞工厂;无法以染色体整合的形式表达足量的重组蛋白,解决以质粒的方式表达重组蛋白遗传稳定性低的问题;无法高效筛选原噬菌体删除株,避免原噬菌体在发酵过程中被各种胁迫诱导脱离染色体导致发酵流产。本文主要以干酪乳杆菌为宿主,围绕建立基因组编辑工具以解决干酪乳杆菌在上述各个领域中遇到的问题展开研究。首先,生物信息学分析并体内验证了原噬菌体重组酶LCABL...
【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：177 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１－１?（Ａ）该图显示发表的与乳酸乳球菌相关文献的增加趋势
??图１－２乳链菌肽控制表达（ＮＩＣＥ）系统原理图（Ｍｉｅｒａｕ＆Ｋ丨ｅｅｒｅｂｅｚｅｎｉ，２００５）〇??Ｆｉｇ．?１－２?Ｎｉｓｉｎ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ?ｇｅｎｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?（ＮＩＣＥ）?ｓｙｓｔｅｍ．??与大肠杆菌中经典的乳糖诱导表达系统类似，围绕乳杆菌中乳糖操纵子启动??子Ｐｉａｃ与合成型ＰｉａｃＳｙｎｔｈ启动子的研宄也有报道（Ｈｅｉｓｓｅｔａｌ．，?２０１６）。其中，Ｌ．ｃａｓｅ／??ＢＬ２３中乳糖诱导表达系统应用最为广泛。Ｚ．ｏｗｄ?ＢＬ２３中乳糖诱导表达系统遵??循严格的葡萄糖抑制以及底物诱导表达机制，这是由于启动子下游基因的转录受??到双重调控：碳代谢抑制（ＣＣＲ）和ＬａｃＴ?（Ａｎｔｉｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）的转录抗终止作用??（图１－３）。因此，在葡萄糖存在时，启动子下游的基因几乎不转录，可以应用于??严谨型蛋白的表达（Ａｌｐｅｒｔ?＆?Ｓｉｅｂｅｒｓ，?１９９７，?Ｍｏｎｅｄｅｒｏ?ｅｔ?ａＬ，?１９９７，?Ｇｏｓａｌｂｅｓ?ｅｔ?ａｌ．，??１９９９）。这一系统的缺点是重组蛋白表达量比ＮＩＣＥ系统低且具有菌株特异性。??此外，Ｐｚｎ－ａＹＲ表达系统和增强型锌诱导表达系统（Ｚｉｎｃ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ??ｓｙｓｔｅｍ，?Ｚｉｒｅｘ）均可与ＮＩＣＥ系统在乳酸乳球菌中同时应用，在无毒的Ｚｎ２＋水平下??实现蛋白的严谨型表达〇＾１１＆卩（＾１＾
传统的乳酸菌靶向基因组修饰大多依赖整合质粒与基因组之间的同源双交??换。利用细胞自身的重组蛋白ＲｅｃＡ介导整合质粒和基因组之间的同源区域发生??同源重组，实现目的基因的插入或敲除（图１－４）。如果使用可以复制的载体作为??整合质粒，需要有筛选方法来区分含有复制质粒的细胞和质粒整合到基因组中的??细胞，目前这样的筛选方法还很少，因此，此方法没有得到广泛的应用。为了避??免上述筛选步骤，研究者利用?ｐＯＲＩ（Ｌａｗ?ｅｔ?ａｌ．，?１９９５），?ｐＵＣ１８／１９（Ｇｒｏｏｔ?ｅｔ?ａｌ．，?２００５）??和ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ?ＳＫ＿（Ｌｅｌｏｕｐ?ｅｔ?ａｌ．，１９９７）等在乳酸菌中不复制的质粒来实现Ｌｃ．??基因的插入失活或外源基因的整合。但是，由于细胞自身的同源重组效率较低，??使用这种方法需要有足够高的转化效率才有可能筛选到发生突变的目标菌株??（Ｍａｇｕｉｎ?ｅｔ?ａｌ．，?１９９２，?Ｆａｎｇ?＆?Ｏ＇Ｔｏｏｌｅ，?２００９）〇??另一种常用的解决方法是使用条件型复制质粒，如温度敏感型质粒ｐＧ＋ｈｏｓｔ??系列质粒（Ｍａｇｕｉｎ?ｅｔ?ａｌ．
本文编号：2977798
【文章来源】：山东大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：177 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１－１?（Ａ）该图显示发表的与乳酸乳球菌相关文献的增加趋势
??图１－２乳链菌肽控制表达（ＮＩＣＥ）系统原理图（Ｍｉｅｒａｕ＆Ｋ丨ｅｅｒｅｂｅｚｅｎｉ，２００５）〇??Ｆｉｇ．?１－２?Ｎｉｓｉｎ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ?ｇｅｎｅ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?（ＮＩＣＥ）?ｓｙｓｔｅｍ．??与大肠杆菌中经典的乳糖诱导表达系统类似，围绕乳杆菌中乳糖操纵子启动??子Ｐｉａｃ与合成型ＰｉａｃＳｙｎｔｈ启动子的研宄也有报道（Ｈｅｉｓｓｅｔａｌ．，?２０１６）。其中，Ｌ．ｃａｓｅ／??ＢＬ２３中乳糖诱导表达系统应用最为广泛。Ｚ．ｏｗｄ?ＢＬ２３中乳糖诱导表达系统遵??循严格的葡萄糖抑制以及底物诱导表达机制，这是由于启动子下游基因的转录受??到双重调控：碳代谢抑制（ＣＣＲ）和ＬａｃＴ?（Ａｎｔｉｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）的转录抗终止作用??（图１－３）。因此，在葡萄糖存在时，启动子下游的基因几乎不转录，可以应用于??严谨型蛋白的表达（Ａｌｐｅｒｔ?＆?Ｓｉｅｂｅｒｓ，?１９９７，?Ｍｏｎｅｄｅｒｏ?ｅｔ?ａＬ，?１９９７，?Ｇｏｓａｌｂｅｓ?ｅｔ?ａｌ．，??１９９９）。这一系统的缺点是重组蛋白表达量比ＮＩＣＥ系统低且具有菌株特异性。??此外，Ｐｚｎ－ａＹＲ表达系统和增强型锌诱导表达系统（Ｚｉｎｃ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ??ｓｙｓｔｅｍ，?Ｚｉｒｅｘ）均可与ＮＩＣＥ系统在乳酸乳球菌中同时应用，在无毒的Ｚｎ２＋水平下??实现蛋白的严谨型表达〇＾１１＆卩（＾１＾
传统的乳酸菌靶向基因组修饰大多依赖整合质粒与基因组之间的同源双交??换。利用细胞自身的重组蛋白ＲｅｃＡ介导整合质粒和基因组之间的同源区域发生??同源重组，实现目的基因的插入或敲除（图１－４）。如果使用可以复制的载体作为??整合质粒，需要有筛选方法来区分含有复制质粒的细胞和质粒整合到基因组中的??细胞，目前这样的筛选方法还很少，因此，此方法没有得到广泛的应用。为了避??免上述筛选步骤，研究者利用?ｐＯＲＩ（Ｌａｗ?ｅｔ?ａｌ．，?１９９５），?ｐＵＣ１８／１９（Ｇｒｏｏｔ?ｅｔ?ａｌ．，?２００５）??和ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ?ＳＫ＿（Ｌｅｌｏｕｐ?ｅｔ?ａｌ．，１９９７）等在乳酸菌中不复制的质粒来实现Ｌｃ．??基因的插入失活或外源基因的整合。但是，由于细胞自身的同源重组效率较低，??使用这种方法需要有足够高的转化效率才有可能筛选到发生突变的目标菌株??（Ｍａｇｕｉｎ?ｅｔ?ａｌ．，?１９９２，?Ｆａｎｇ?＆?Ｏ＇Ｔｏｏｌｅ，?２００９）〇??另一种常用的解决方法是使用条件型复制质粒，如温度敏感型质粒ｐＧ＋ｈｏｓｔ??系列质粒（Ｍａｇｕｉｎ?ｅｔ?ａｌ．
本文编号：2977798
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