内源性过表达Nestin对NIH3T3细胞增殖、迁移及MAPK信号传导通路的影响

发布时间：2021-08-09 23:01

　　目的通过在成纤维细胞NIH3T3中内源性过表达巢蛋白（Nestin）,研究其对细胞增殖、迁移及转化生长因子（TGF-β1）作用下细胞胶原蛋白表达与MAPK相关通路的影响。方法通过CRISPR/SAM技术构建内源性过表达Nestin的细胞株,用MTS实验、Western blot检测细胞增殖能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,经qPCR、Western blot与免疫荧光染色明确TGF-β1对其胶原蛋白与MAPK通路的影响。结果 CRISPR/SAM技术能使内源性Nestin表达显著提高（P<0.05）,而内源性过表达Nestin对NIH3T3细胞的生长、迁移有明显促进作用（P<0.05）,对TGF-β1诱导的胶原蛋白表达及MAPK的激活也有明显的抑制效应（P<0.01）。结论用CRISPR/SAM技术内源性过表达Nestin可以明显促进NIH3T3细胞的生长和迁移,但却抑制TGF-β1诱导下胶原蛋白的表达及MAPK的激活。 

【文章来源】：第三军医大学学报. 2020,42(02)北大核心CSCD

【文章页数】：8 页

【部分图文】：

内源性过表达Nestin LV-sgRNA-MS2-P65-HSF1-Neo质粒构测序

qPCR检测所构建细胞的Nestin的表达水平,解链曲线(图2A)证实反应特异性高,qPCR检测结果显示,Nes-sgRNA #1、#2、#3和对照组con的mRNA相对表达水平为(20.30±6.025)、(1.858±0.634)、(29.20±4.201)、(1.033±0.152),差异具有统计学意义(P<0.05),其中#1和#3表达量最高(与对照组con相比,P<0.01)(图2B)。Western blot检测结果显示,Nes-sgRNA #1、#2、#3、对照组con的蛋白相对表达水平为(0.540±0.045)、(0.036±0.008)、(0.469±0.030)、(0.024±0.008),差异具有统计学意义(P<0.05)(图2C、D)。与qPCR结果相似,Nes-sgRNA#1和#3细胞Nestin相对表达量最高(与对照组con相比,P<0.01),后续实验选择#1和#3细胞继续进行。免疫荧光IF验证了Nes-sgRNA #1和#3调控Nestin的表达模式,结果显示细胞模型中Nestin的表达模式与对照一致,Nestin蛋白在细胞质表达,形成轻微弯曲的纤维,以放射状形式从核周发散出去。免疫荧光也证实,与对照相比Nes-sgRNA#1和#3细胞中Nestin表达更多(图2E)。2.2 内源性过表达Nestin对NIH3T3细胞增殖的影响

细胞划痕实验检测内源性过表达Nestin后成纤维细胞的侧向迁移能力,结果显示,与对照组相比,过表达内源性Nestin后成纤维细胞的迁移能力明显增强,结果表明,12 h的时候,#1和#3组细胞中内源性过表达Nestin后,迁移能力更好 (P<0.01,图4)。图4 划痕实验检验NIH3T3细胞内源性过表达Nestin后对迁移的影响


本文编号：3332945