N-糖基转移酶酶学性质的探究及应用
发布时间：2023-12-09 11:34
蛋白质糖基化是蛋白翻译后的主要修饰过程,近来,在工业应用中利用大肠杆菌生产重组蛋白,以获得糖基化治疗性蛋白的进程,已有稳步发展。细菌多糖蛋白质缀合物的传统生产方式是化学法,多糖和蛋白质的连接主要采用化学反应进行,使用化学方法把糖链添加到载体蛋白上具有生产过程步骤繁多,生产成本高,糖基化位置不确定和糖链数目难以控制等弊端。生物法合成可以明显地避免这些弊端。最近,在细菌中发现了一种细胞质可溶性N-糖基转移酶(N-glycosyltransferase,NGT),它以活化的糖-核苷酸作为供体底物,将已糖转移至蛋白质或多肽序列(N-(X(?)P)-S/T)的天冬酰胺(Asn)侧链上。目前发现的NGT类酶数量有限,还未见到NGT介导的糖蛋白缀合物疫苗的报道。基于NGT的巨大应用价值,理解NGT酶学性质对糖生物学领域具有重要意义。我们选用肺炎链球菌疫苗中常出现的肺炎链球菌3型,在了解NGT酶学性质的基础上,建立合酶依赖细菌多糖蛋白质疫苗生产平台,提供一种新的糖蛋白缀合物疫苗合成生产方法。拓展酶法合成合酶依赖型细菌多糖蛋白质缀合物疫苗的应用范围。我们需要鉴定更多具有底物特异性的不同来源NGT同种型,...
【文章页数】：99 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
1.1 生物中的N-糖基化系统
1.1.1 微生物中蛋白糖基化
1.1.2 蛋白质的整体N-糖基化
1.1.3 蛋白质的连续N-糖基化
1.1.4 糖基转移酶(Glycosyltransferases,GTs)
1.2 糖缀合物疫苗
1.2.1 细菌多糖
1.2.2 糖蛋白
1.2.3 细菌多糖疫苗
1.2.4 糖缀合物疫苗
1.3 细菌多糖合酶依赖型糖蛋白疫苗
1.3.1 肺炎链球菌3型荚膜多糖
1.3.2 肺炎链球菌荚膜多糖合成机制
1.3.3 肺炎链球菌3型多糖合成酶(Cps3S)
第二章 不同来源的N-糖基转移酶肽底物特异性
2.1 实验材料
2.1.1 菌株和质粒
2.1.2 主要试剂和耗材
2.1.3 主要仪器
2.1.4 主要培养基和缓冲液的配置
2.2 实验方法
2.2.1 不同来源NGT的序列比对
2.2.2 不同来源的NGT的诱导表达
2.2.3 不同来源的NGT的纯化
2.2.4 不同来源NGT的检测
2.2.5 不同来源的NGT蛋白浓度的测定
2.2.6 不同来源NGT体外酶活的测定
2.2.7 KkNGT酶学性质的测定
2.2.8 不同来源NGT肽底物特异性的比较
2.2.9 BtNGT的C末端缺失突变体(BtNGTct)的探究
2.2.9.1. 质粒pET22b
2.2.9.2. C末端缺失突变体的目的基因的获得
2.2.9.3. 构建载体pET22b- BtNGTct
2.2.9.4. BtNGT C末端截短对糖供体的影响
2.3 实验结果
2.3.1 NGT的鉴定
2.3.2 不同来源NGT的纯化与检测
2.3.3 不同来源NGT酶活测定
2.3.4 KkNGT酶学性质的测定
2.3.5 不同来源NGT肽底物特异性的比较
2.3.6 BtNGT的C末端缺失突变体(BtNGTct)的探究
2.4 讨论
第三章 基于NGT糖基化途径的蛋白N-糖基化修饰
3.1 实验材料
3.1.1 菌株和载体
3.1.2 主要试剂和耗材
3.1.3 主要仪器
3.1.4 主要培养基和缓冲液的配置
3.2 实验方法
3.2.1 构建株E. coli DH5α(pET28a-CRM197-AaNGT)
3.2.2 pET28a-CRM197-AaNGT重组子的表达及纯化
3.2.3 糖基化蛋白CRM197的Western-Blot验证
3.2.4 MALDI-TOF鉴定分析重组蛋白的糖基化
3.2.5 构建菌株E.coli DH5α( pRSFDuet-FHT-AaNGT)
3.2.6 单糖基化FHT-Glc蛋白的表达及纯化
3.2.7 重组蛋白的糖基化鉴定分析
3.2.8 α-1,6-葡糖基转移酶(α1,6GlcT)的应用
3.3 实验结果
3.3.1 菌株E. coli DH5α (pET28a-CRM197-AaNGT)的验证
3.3.2 pET28a-CRM197-AaNGT重组子的表达及纯化
3.3.3 重组蛋白CRM197糖基化的MALDI-TOF鉴定分析
3.3.4 菌株E.coli DH5α( pRSFDuet-FHT-AaNGT)的验证
3.3.5 FHT及单糖基化蛋白FHT-Glc的表达及纯化
3.3.6 FHT及FHT-Glc的MALDI-TOF鉴定分析
3.3.7 α-1,6-葡糖基转移酶(α1,6GlcT)的应用
3.4 讨论
第四章 肺炎链球菌3型细菌胞外多糖合成酶初步探究
4.1 实验材料
4.1.1 菌株和质粒
4.1.2 主要试剂和耗材
4.1.3 主要仪器
4.1.4 主要培养基和缓冲液的配置
4.2 实验方法
4.2.1 Cps3S的表达及纯化
4.2.2 Cps3S跨膜端缺失后的载体构建与表达纯化
4.3 实验结果
4.3.1 Cps3S的表达及纯化
4.3.2 Cps3S跨膜端缺失后的载体构建
4.3.3 Cps3S跨膜端缺失后的表达纯化
4.4 讨论
全文总结
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文
学位论文评阅及答辩情况表
本文编号：3871492
【文章页数】：99 页
【学位级别】：硕士
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中文摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
1.1 生物中的N-糖基化系统
1.1.1 微生物中蛋白糖基化
1.1.2 蛋白质的整体N-糖基化
1.1.3 蛋白质的连续N-糖基化
1.1.4 糖基转移酶(Glycosyltransferases,GTs)
1.2 糖缀合物疫苗
1.2.1 细菌多糖
1.2.2 糖蛋白
1.2.3 细菌多糖疫苗
1.2.4 糖缀合物疫苗
1.3 细菌多糖合酶依赖型糖蛋白疫苗
1.3.1 肺炎链球菌3型荚膜多糖
1.3.2 肺炎链球菌荚膜多糖合成机制
1.3.3 肺炎链球菌3型多糖合成酶(Cps3S)
第二章 不同来源的N-糖基转移酶肽底物特异性
2.1 实验材料
2.1.1 菌株和质粒
2.1.2 主要试剂和耗材
2.1.3 主要仪器
2.1.4 主要培养基和缓冲液的配置
2.2 实验方法
2.2.1 不同来源NGT的序列比对
2.2.2 不同来源的NGT的诱导表达
2.2.3 不同来源的NGT的纯化
2.2.4 不同来源NGT的检测
2.2.5 不同来源的NGT蛋白浓度的测定
2.2.6 不同来源NGT体外酶活的测定
2.2.7 KkNGT酶学性质的测定
2.2.8 不同来源NGT肽底物特异性的比较
2.2.9 BtNGT的C末端缺失突变体(BtNGTct)的探究
2.2.9.1. 质粒pET22b
2.2.9.2. C末端缺失突变体的目的基因的获得
2.2.9.3. 构建载体pET22b- BtNGTct
2.2.9.4. BtNGT C末端截短对糖供体的影响
2.3 实验结果
2.3.1 NGT的鉴定
2.3.2 不同来源NGT的纯化与检测
2.3.3 不同来源NGT酶活测定
2.3.4 KkNGT酶学性质的测定
2.3.5 不同来源NGT肽底物特异性的比较
2.3.6 BtNGT的C末端缺失突变体(BtNGTct)的探究
2.4 讨论
第三章 基于NGT糖基化途径的蛋白N-糖基化修饰
3.1 实验材料
3.1.1 菌株和载体
3.1.2 主要试剂和耗材
3.1.3 主要仪器
3.1.4 主要培养基和缓冲液的配置
3.2 实验方法
3.2.1 构建株E. coli DH5α(pET28a-CRM197-AaNGT)
3.2.2 pET28a-CRM197-AaNGT重组子的表达及纯化
3.2.3 糖基化蛋白CRM197的Western-Blot验证
3.2.4 MALDI-TOF鉴定分析重组蛋白的糖基化
3.2.5 构建菌株E.coli DH5α( pRSFDuet-FHT-AaNGT)
3.2.6 单糖基化FHT-Glc蛋白的表达及纯化
3.2.7 重组蛋白的糖基化鉴定分析
3.2.8 α-1,6-葡糖基转移酶(α1,6GlcT)的应用
3.3 实验结果
3.3.1 菌株E. coli DH5α (pET28a-CRM197-AaNGT)的验证
3.3.2 pET28a-CRM197-AaNGT重组子的表达及纯化
3.3.3 重组蛋白CRM197糖基化的MALDI-TOF鉴定分析
3.3.4 菌株E.coli DH5α( pRSFDuet-FHT-AaNGT)的验证
3.3.5 FHT及单糖基化蛋白FHT-Glc的表达及纯化
3.3.6 FHT及FHT-Glc的MALDI-TOF鉴定分析
3.3.7 α-1,6-葡糖基转移酶(α1,6GlcT)的应用
3.4 讨论
第四章 肺炎链球菌3型细菌胞外多糖合成酶初步探究
4.1 实验材料
4.1.1 菌株和质粒
4.1.2 主要试剂和耗材
4.1.3 主要仪器
4.1.4 主要培养基和缓冲液的配置
4.2 实验方法
4.2.1 Cps3S的表达及纯化
4.2.2 Cps3S跨膜端缺失后的载体构建与表达纯化
4.3 实验结果
4.3.1 Cps3S的表达及纯化
4.3.2 Cps3S跨膜端缺失后的载体构建
4.3.3 Cps3S跨膜端缺失后的表达纯化
4.4 讨论
全文总结
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文
学位论文评阅及答辩情况表
本文编号：3871492
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