内生链霉菌SAT1的抑菌活性特征及wblA基因的调控功能

发布时间：2024-02-22 05:49

　　药用植物内生菌所处生境独特,经过与植物的长期共同进化而具有合成新颖天然产物活性结构的巨大潜力。本实验室前期从19种药用植物中分离得到94株拮抗内生菌,论文通过多步骤活性检测方法,结合生物信息学分析对其抑菌机制进行初步预测,并利用基因工程和qPCR技术进行验证,来探索目标菌株的抑菌活性特征。论文主要包括如下四部分内容:1.多步骤活性检测方法确定目标菌株SAT1。将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)作为指示菌,以94株拮抗内生菌为研究对象,初步筛选得到8株抑菌效果较强(抑菌带宽>1.0 cm)的菌株。通过抑菌谱实验、发酵液抑菌活性实验以及离体枝条实验等多步骤分析,发现内生链霉菌SAT1对栗疫菌、白假丝酵母等八种指示菌均具有抑制效果,并且对欧美杨溃疡病和板栗疫病表现出一定的生防效果,优于其它菌株,因此,将其作为本论文的研究对象。2.SAT1次级代谢基因簇抑菌活性物质预测。通过antiSMASH分析Streptomyces sp.SAT1全基因组序列,一共预测到29种次级代谢产物生物合成基因簇。其中Cluster24和Cluster25与具有抑菌活性的潮霉素B和默诺霉素的生物合成基因簇...

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 引言
    1.1 链霉菌的开发应用
        1.1.1 链霉菌属(Streptomyces)及其应用
        1.1.2 链霉菌天然产物发现策略
        1.1.3 链霉菌基因工程操作技术
    1.2 链霉菌调控基因
        1.2.1 调控基因的分类
        1.2.2 常见的调控基因
        1.2.3 多效性负调控基因wbIA
    1.3 荧光定量PCR技术
        1.3.1 荧光定量PCR内参基因
        1.3.2 内参基因选择工具及其应用
        1.3.3 常用的链霉菌内参基因
    1.4 本课题研究意义、主要内容及技术路线
        1.4.1 研究意义
        1.4.2 研究内容
        1.4.3 技术路线
2 高抑菌活性生防菌株的筛选与鉴定
    2.1 实验材料
        2.1.1 供试菌株和指示菌
        2.1.2 试验苗木
        2.1.3 培养基
        2.1.4 主要试剂和仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 拮抗内生菌初筛及抑菌谱的检测
        2.2.2 发酵液抑菌活性的检测
        2.2.3 拮抗菌株鉴定
        2.2.4 生防实验
    2.3 结果
        2.3.1 拮抗菌株筛选及抑菌谱检测
        2.3.2 菌株鉴定
        2.3.3 不同发酵培养基对MRSA抑菌活性的影响
        2.3.4 离体枝条实验
    2.4 讨论
    2.5 小结
3 SAT1次级代谢基因簇分析及活性物质的检测
    3.1 实验材料
        3.1.1 培养基
        3.1.2 实验试剂和仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 活性物质的萃取
        3.2.2 TLC法检测目标抗生素
        3.2.3 HPLC法检测目标抗生素
        3.2.4 生物信息学分析
    3.3 实验结果
        3.3.1 Streptomyces sp. SAT1次级代谢产物预测
        3.3.2 SAT1发酵液中活性物质的萃取
        3.3.3 TLC和HPLC法检测目标抗生素
        3.3.4 Cluster 24和25的同源性比较分析
    3.4 讨论
    3.5 小结
4 wblA表达载体的构建及其对SAT1形态及抑菌活性的影响
    4.1 实验材料
        4.1.1 供试菌株和质粒
        4.1.2 引物合成及测序
        4.1.3 试剂、试剂盒和主要仪器
    4.2 实验方法
        4.2.1 质粒DNA和链霉菌基因组DNA的提取
        4.2.2 PCR反应条件
        4.2.3 DNA片段的纯化、酶切和连接反应
        4.2.4 甘油法制备感受态细胞和电转化
        4.2.5 大肠杆菌和链霉菌的属间接合转移
        4.2.6 突变株的验证及其表型特征和抑菌活性的变化
    4.3 结果与分析
        4.3.1 wblA表达载体的构建和突变株的获得
        4.3.2 突变株遗传稳定性和表型特征
        4.3.3 突变株抑菌能力的变化
    4.4 讨论
    4.5 小结
5 荧光定量PCR检测wblA对目标基因簇表达量的影响
    5.1 实验材料
        5.1.1 菌株
        5.1.2 试剂盒
        5.1.3 引物
        5.1.4 实验仪器
    5.2 实验方法
        5.2.1 样品准备
        5.2.2 总RNA提取和qPCR
        5.2.3 数据处理与分析
    5.3 结果与分析
        5.3.1 候选内参基因引物的扩增效率及特异性
        5.3.2 内参基因稳定性评估
        5.3.3 目的基因表达量分析
    5.4 讨论
    5.5 小结
6 结论与展望
    6.1 创新点
    6.2 结沦
    6.3 展望
参考文献
个人简介
导师简介
致谢



本文编号：3906490