2型糖尿病胰岛素抵抗对心肌损伤的实验研究

　　糖尿病心肌损伤与糖尿病患者的高心力衰竭发生率和高病死率密切相关，因此，研究建立糖尿病心肌损伤模型对研究糖尿病心肌病理生理特点及防治药物的研发具有十分重要的意义。

　　本研究应用高脂饲料和小剂量链脲佐菌素腹腔注射，成功地诱发了2型糖尿病及心肌病理损伤模型，并探讨了心肌损伤的可能机制。

　　1 材料与方法

　　1．1 实验动物清洁级雄性SD大鼠180～200g，鼠龄为(504-3)d，30只，由北京维通利华实验动物有限公司提供；合格证号：SCXK(京)一2007～0001。大鼠自由饮水、进食，室温(25 4-2) ，分笼喂养，适应性喂养1w。饲料：普通大鼠饲料(热卡百分比为脂肪14％ ，能量359．4千卡／10Qg)和高脂饲料(热卡百分比为脂肪59％ ，能量475．2千卡／lOOg)：均由北京科奥协力饲料有限公司提供，合格证号：SCXK(京)一2005—0007。单笼饲养在恒温(25℃)的动物房中。每天光照12h，自由饮水。

　　1．2 主要试剂链脲佐菌素(STZ)(sigma公司)；康博士血糖试纸(上海罗氏诊断产品有限公司)；总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；AngⅡ、TNF、胰岛素试剂盒(北京邦定泰克生物技术有限公司)。

　　1．3 主要仪器电子天平(上海第二天平仪器厂)、TGL一16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂)、液氮生物容器YNZ一35—5O(四川亚西机械厂) 自动双重纯水蒸馏器sZ一93(上海容亚生化仪器厂)、光学显微镜及摄像系统(日本Nikon公司产品)、超低温冰箱(三洋电机株式会社)、电热恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)、超薄切片机(德国Leica RM2145)数码相机(日本佳能公司)、血糖仪(上海罗氏诊断产品有限公司)、Fr630G型微机多探头放免仪(北京市核仪器厂)、GL一20G—II型高速冷冻离心机(上海医用分析仪器厂)、日立850荧光分光光度计(日本日立公司)。

　　1．4 方法

　　1．4．1 动物分组及喂食。大鼠适应饲养1 w后，将大鼠按体质量随机分为对照组12只与高脂组l8只。对照组喂饲普通块料，高脂组喂饲高脂饲料。2组喂食lOw后，禁食6h，高脂组腹腔注射STZ30mg／kg建立大鼠糖尿病模型，STZ临用前用0．1mol／L的柠檬酸一柠檬酸钠溶液(pH=4．3)稀释为1％ 的浓度，避光放在冰板上，快速腹腔注射。同时正常对照组腹腔注射柠檬酸一柠檬酸钠溶液。1w后同法同剂量再一次腹腔注射STZ。末次腹腔注射STZ，1w后用血糖仪测定空腹血糖和糖耐量，以空腹血糖≥11．1mmol／L，同时糖耐量的OGTY．曲线下面积大于正常对照组的160％的2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠作为对象，造模成功15只。

　　1．4．2 检测指标

　　1．4．2．1 空腹血糖。禁食6h，用血糖仪测尾静脉血糖。

　　1．4．2．2 糖耐量(OGTY)。大鼠禁食6h，然后称重，灌胃20％葡萄糖溶液10 mL／kg，分别于0、30、60、120min尾静脉取血用血糖仪测定空腹血糖值(FBG)，并计算OGTY曲线下面积，以评价大鼠的胰岛素敏感性。

　　1．4．2．3 血液检测指标。大鼠糖耐量测定后，水合氯醛麻醉，颈总动脉取血，放免法测定血浆胰岛素(INS)，笔耕文化传播，全自动生化分析仪测血清胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)。

　　1．4．2．4 心脏检测指标。取血后处死，并摘取心脏用电子天平称全心重和左心室重量，并计算心脏重量指数(心脏重量与体质量相比，HWI，单位msZg)和左室重量指数(大鼠左心室重量与体质量比，LVMI，单位ms／g)。之后立即将左心室放人10％甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，5 p,m厚连续切片，HE染色，光镜下观察心肌组织形态学改变。各大鼠取右室用生理盐水制成10％心肌组织匀浆，3 000 r／min离心15 min，吸取上清液迅速放一80~C，备用于测定下列指标：应用荧光法测定心肌组织糖基化终末产物(AGEs)含量(心肌组织上清在荧光分光光度计上测定荧光强度，激发波长370nm，发射波长440nm，狭缝3 nm。

　　以牛血清白蛋白浓度为1．0 g／L的PBS荧光值为1个自定义荧光单位(Arbitrary Units of Fluorescence，AUF，样品荧光强度以此折算)。用放免法按试剂盒说明书检测心肌组织TNF—IX和AngII。

　　1．5 统计学处理实验数据用计算机SPSS 10．0软件处理，以(x±s)表示，用t检验进行组间比较。

　　2 结果

　　2．1 两组大鼠糖耐量情况从数据表及数据图中可见，正常对照组灌服葡萄糖后2小时血糖水平基本恢复正常，高脂组糖耐量各点血糖值均较正常对照组明显增高，2小时血糖水平仍然很高，OG'I3比正常对照组也明显增大，符合临床2型糖尿病胰岛素抵抗。说明模型组已产生对胰岛素的抵抗，表明模型的建立是成功的。

　　2．2 两组大鼠血清(浆)FBG、INS、TG和TC水平见表2。表2结果显示，2型糖尿病组大鼠血清(浆)FBG、INS、TG和Tc水平较正常对照组均明显升高(P<0．01)。

　　2．3 两组大鼠左室重量指数及心脏重量指数的变化与正常对照组比，糖尿病模型组大鼠左室重量指数及心脏重量指数明显升高(P<0．01)。

　　2．4 两组大鼠心肌组织TNF一、AngII和AGEs的水平与正常组比较，糖尿病模型组心肌组织TNF一 、AngII和AGEs的含量均明显升高(P<0．01)。见表4。

　　2．5 两组大鼠心肌组织光镜下形态结构观察HE染色光镜下可见正常对照组大鼠心肌组织无明显形态结构的改变，糖尿病模型组大鼠心肌细胞明显肿胀肥大、变性、核明显增大，心肌纤维排列和结构紊乱。

　　3 讨论糖尿病心肌病变是糖尿病主要并发症之一，建立理想的动物模型进而深入研究其发病机制及药物的治疗作用，具有重要的意义和价值。本实验用高脂饲料喂养联合腹腔注射小剂量STZ成功诱导了2型糖尿病心肌病变的大鼠模型 ，表现为高血糖和胰岛索抵抗，血液TG、TC、INS明显升高，而糖耐量明显降低，类似临床2型糖尿病，表明体内存在代谢紊乱。心脏中脂肪酸和脂质代谢紊乱在促进心功能不全中起重要作用，大量研究显示，糖尿病心肌损害致心功能不全与血脂增加，尤其是TG的增加有关。糖尿病时TG和Tc等脂滴颗粒在心肌细胞内聚积增多，均可形成高脂血症而损伤心肌细胞。本实验结果显示糖尿病模型组大鼠左室重量指数和心脏指数增加，心肌细胞增大，心肌纤维结构紊乱，说明本试验中糖尿病大鼠心肌病变损伤已形成。