重组减毒沙门氏菌鸭瘟病毒DNA疫苗的构建及其口服免疫效果研究

发布时间：2017-10-14 15:18

  本文关键词：重组减毒沙门氏菌鸭瘟病毒DNA疫苗的构建及其口服免疫效果研究

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【摘要】：本论文以质粒pVAXl和pGL3-control为基础,辅以重要元件(CpG免疫基序、核靶向序列、asd基因等),利用类生物学合成方法构建出一种新颖的通用型DNA疫苗载体,命名为pkDNA。酶切连接绿色荧光蛋白基因(egfP)'体外转染COS-7细胞证实该质粒具有pVAXl相似的真核表达能力。选取鸭瘟病毒gB糖蛋白膜外区域编码基因和UL24基因为抗原基因,大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(E.coli LTB)基因和鸭IL-2mRNA反转录cDNA为分子佐剂构建多种鸭瘟病毒DNA疫苗质粒。以c8276 Acrp/cya(鼠伤寒沙门氏菌UK-1 △asd｛crp△cya缺失株)为口服免疫途径递送活菌载体,20日龄麻鸭口服免疫重组减毒沙门氏菌鸭瘟病毒DNA疫苗两次,均能产生较高的体液及粘膜免疫应答,并在一定程度上抵抗鸭瘟病强毒株的挑战,其中c8276△crp/cya (pkDNA-UL24-LTB)组效果显著。结果如下：一种新颖通用型DNA疫苗载体的构建：利用类生物学合成方法合成全新DNA疫苗载体pkDNA:以UK-1基因组、pVAX1和pGL3-control为模板PCR扩增获得基因片段asd, pUC、CMVMCS、BGH　poly(A)、SV40 enhancer和SV40 late poly(A)片段：重叠PCR两两融合构建三模块片段：(1/2DTSII+asd/+CpG+PUC)、(BGH poly A+CpG+SV40 enhancer)和(MVMCS+CpG+SV40 polyA+1/2DTSII);最后利用Gibson Assembly(?) Master Mix(New England Biolabs(?)inc.)完成pkDNA质粒的类生物合成。两次测序结果表明与理论序列相符,酶切连接绿色荧光蛋白基因(egfp),直接荧光法可见绿色荧光蛋白在COS-7细胞中很好的表达,其真核表达能力与pVAX1相似。鸭瘟病毒DNA疫苗的构建及其体外表达能力检测：PCR扩增tgB(451-1650bp)、 UL24、LTB、和鸭IL-2基因；重叠PCR扩增得到UL24-LTB. UL24-DuIL2融合片段。单抗原基因及融合基因酶切连接pkDNA,完成鸭瘟病毒DNA疫苗质粒:pkDNA-tgB、 pkDNA-UL24、pkDNA-UL24-LTB、pkDAN-UL24-DuIL2,测序鉴定无误。所有DNA疫苗质粒瞬时转染COS-7细胞,间接免疫荧光检测转染24小时后的细胞,均可见强烈的绿色荧光信号,而空质粒转染组及空白组荧光不明显；48小时后,收集细胞,提取总RNA, RT-PCR检测可见pkDNA-UL24-LTB和pkDNA-UL24-DuIL2转染组中佐剂基因特异性转录。c$276△crp/cya弱毒株及重组减毒沙门氏菌鸭瘟病毒DNA疫苗菌株的构建：以鼠伤寒沙门氏菌c8276(UK-1△ash/)△crp缺失株为亲本构建c8276 △crp/cya弱毒株,经PCR及麦康凯(麦芽糖+)平板鉴定表明突变株构建成功。鸭瘟病毒DNA疫苗质粒电转c82776△crp/cya,获得系列重组沙门氏菌鸭瘟病毒DNA疫苗菌株：c8276△crp/cya (pkDNA-tgB)、c8276△crp/cya(pkDNA-UL24)、c8216△crp/cya (pkDNA-UL24-LTB)、 c8276｛crp/cya(pkDAN-UL24-DuIL2), c8276△crp/cya(pVAXl-UL24)及 c8276△crp/cya (pkDNA);LB平板上连续划线培养20代,PCR鉴定显示DNA疫苗质粒在c8276Acrp/cya中遗传稳定性良好,且不影响菌株生长；7日龄麻鸭口服接种高达1012CFUc8276Acrp/cya(pkDNA),两周内小鸭食欲饮欲正常,剖检各器官组织无任何病症现象,重组疫苗安全性良好。重组减毒沙门氏菌鸭瘟病毒DNA疫苗免疫效果研究：20日龄麻鸭随机分成7组,记为A-G:A.c8276△crp/cya(pkDNA-UL24)、B.c8276△crp/cya(pkDNA-UL24-LTB)、 C.c8276△crp/cya(pkDAN-UL24-DuIL2)、D.c8276△crp/cya(pkDNA-tgB)+c8276△crp/cya (pkDNA-UL24)、E.c8276△crp/cya(pVAX1-UL24)、F.c8276Acrp/cya(pkDNA)及G.BSG组,每组15只,每只口服免疫1012CFU重组疫苗菌株,共免疫两次,每次间隔2周。一免后第10天、21天和28天每组随机挑选6只采集血清,一免后第21天,每组随机选取5只采集胆汁及十二指肠粘液,分别检测针对tUL24蛋白及DEV病毒颗粒的抗体应答水平,二免两周后DEV强毒株CHv经口攻毒检测疫苗保护力水平。结果显示：B组诱导最高的胆汁IgA抗体水平(P0.05),B组和C组产生的血清IgY抗体水平高于其他组(P0.05),D组麻鸭产生更高的抗DEV的抗体水平比起抗tUL24；所有实验组(A-D)和阳性对照E组产生的抗体水平显著性高于F和G组(P0.01)；攻毒12天后B组存活率最高(9/10),D组随之7/10,C与E组相同6/10,A组偏低仅5/10,均明显高于F(2/10)和G组(0)。
【关键词】：DNA疫苗载体 鸭瘟病毒DNA疫苗 减毒沙门氏菌 重组疫苗 口服免疫
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-12
• 第一章 减毒沙门氏菌递送鸭瘟DNA疫苗的研究进展12-24
• 1 减毒沙门氏菌用于DNA疫苗递送12-14
• 1.1 沙门氏菌与宿主细胞的相互作用12-13
• 1.2 减毒沙门氏菌作为疫苗载体13
• 1.3 减毒沙门氏菌用于DNA疫苗递送的优势及研究进展13-14
• 2 DNA疫苗的研究进展14-20
• 2.1 DNA疫苗概述15
• 2.2 增强DNA疫苗效力的方法15-19
• 2.3 DNA疫苗口服免疫途径的应用19-20
• 3 鸭瘟概述20-22
• 3.1 鸭瘟概述20
• 3.2 鸭瘟病毒免疫原性特征20-21
• 3.3 鸭瘟病毒DNA疫苗的研究现状21-22
• 4 选题目的和意义22-24
• 第二章 新颖通用型DNA疫苗载体的构建及其真核表达能力的研究24-37
• 1 材料24-25
• 1.1 主要质粒、菌株、细胞及试剂24-25
• 1.2 主要的仪器设备25
• 2 方法25-29
• 2.1 单元基因引物设计25-26
• 2.2 单元基因片段扩增26-27
• 2.3 (1/2DTSⅡ+asd+CpG+pUC),(BGH late poly A+CpG+SV40 enhancer)和(CMVMCS+CpG+SV40late poly A+1/2DTSⅡ)模板片段的构建27-28
• 2.4 类生物合成新颖通用型DNA疫苗载体pkDNA28
• 2.5 pkDNA载体质粒的酶切及测序鉴定28
• 2.6 pkDNA-egfp质粒的构建28-29
• 2.7 荧光显微镜观察pkDNA-egfp质粒在COS-7中的表达29
• 3 结果29-34
• 3.1 单片段的PCR扩增结果29-30
• 3.2 三模板片段的融合PCR结果30-31
• 3.3 pkDNA质粒的合成及PCR鉴定31
• 3.4 pkDNA测序结果31-32
• 3.5 pkDNA-egfp质粒的构建32-33
• 3.6 荧光显微镜观察pkDNA-egfp质粒在COS-7中的表达结果33-34
• 4 讨论34-36
• 4.1 平衡致死质粒宿主系统作为质粒筛选的优势34
• 4.2 CpG基序作为DNA疫苗佐剂的优势34-35
• 4.3 核靶向序列(nuclear targeting sequences,DTS)对抗原表达量的影响35
• 4.4 多聚腺苷酸的作用35
• 4.5 类生物合成法构建质粒的优势35-36
• 5 小结36-37
• 第三章 鸭瘟DNA疫苗质粒的构建及体外表达能力检测37-50
• 1 材料37-38
• 1.1 质粒、病毒、菌株及细胞37
• 1.2 主要试剂37
• 1.3 主要的仪器设备37-38
• 2 方法38-42
• 2.1 抗原基因UL24、tgB(451-1670bp)及佐剂基因LTB、DuIL2的PCR扩增38-39
• 2.2 重叠PCR构建UL24-LTB、UL24-DuIL2融合基因39
• 2.3 单抗原基因及抗原与佐剂的融合基因酶切连接pkDNA疫苗载体及鉴定39
• 2.4 tUL24蛋白及tgB截断蛋白的原核表达及纯化39-40
• 2.5 兔抗tgB及tUL24截断蛋白血清的制备40
• 2.6 鸭瘟DNA疫苗质粒的体外表达能力检测40-42
• 3 结果42-47
• 3.1 抗原基因UL24、tgB及佐剂基因LTB、Du1L2的PCR扩增结果42
• 3.2 重叠PCR构建UL24-LTB和UL24-Du1L2融合基因结果42-43
• 3.3 鸭瘟DNA疫苗的测序结果43
• 3.4 截断蛋白tgB(451-1650bp)及tUL24(720-1230bp)的原核表达及纯化43-45
• 3.5 琼脂糖扩散实验验证兔抗tgB和tUL24血清效价45
• 3.6 间接免疫荧光检测鸭瘟DNA疫苗质粒在COS-7细胞中的表达结果45-47
• 3.7 RT-PCR检测鸭瘟DNA疫苗质粒在COS-7细胞中的表达结果47
• 4 讨论47-48
• 4.1 外源囊膜糖蛋白对细菌生理特征的影响47-48
• 4.2 从蛋白及基因水平来检测鸭瘟DNA疫苗在体外细胞内的表达48
• 5 小结48-50
• 第四章 弱毒沙门氏菌c8276△crp/cya的构建及以此为基础的重组减毒沙门氏菌鸭瘟病毒DNA疫苗的构建及鉴定50-60
• 1 材料50-51
• 1.1 主要质粒、菌株及试剂50
• 1.2 主要的仪器设备50-51
• 2 方法51-54
• 2.1 cya上下游基因的扩增51
• 2.2 cya上下游同源臂的融合51
• 2.3 cya上下游融合基因酶切连接pRE112质粒及鉴定51-52
• 2.4 质粒pRE112-△cya转染供体菌株52
• 2.5 在减毒鼠伤寒沙门氏菌c8276△crp基础上构建c8276△crp/cya52
• 2.6 缺失株c8276△crp/cya的生化鉴定52-53
• 2.7 鸭瘟DNA疫苗质粒电转c8276△crp/cya感受态53
• 2.8 鸭瘟DNA疫苗质粒在c8276△crp/cya中的稳定性鉴定53
• 2.9 重组减毒鼠伤寒沙门氏菌c8276△crp/cya鸭瘟DNA疫苗的安全性鉴定53-54
• 3 结果54-57
• 3.1 cya上下游基因的扩增及融合结果54
• 3.2 pRE112-△cya质粒的鉴定54-55
• 3.3 c8276△crp菌株与c7213(pRE112-△cy)结合单菌落PCR鉴定55
• 3.4 c8276△crp/cya的鉴定55-56
• 3.5 鸭瘟DNA疫苗质粒电转入c8276△crp/cya的PCR鉴定结果56
• 3.6 鸭瘟DNA疫苗质粒在c8276△crp/cya中的稳定性鉴定结果56
• 3.7 重组减毒鼠伤寒沙门氏菌c8276△crp/cya鸭瘟DNA疫苗的安全性鉴定结果56-57
• 4 讨论57-59
• 4.1 自杀质粒介导的同源重组方法构建突变株57
• 4.2 鼠伤寒沙门氏菌△crp/cya双缺失株作为疫苗载体的应用57-58
• 4.3 pkDNA质粒对c8276△crp/cya的生理特性的影响58
• 4.4 重组减毒鼠伤寒沙门氏菌c8276△crp/cya鸭瘟DNA疫苗的稳定性及安全性评价的意思58-59
• 5 小结59-60
• 第五章 麻鸭口服免疫重组c8276△crp/cya DEV-DNA疫苗的免疫效果研究60-74
• 1 材料60-61
• 1.1 实验动物60
• 1.2 菌株及病毒60
• 1.3 主要试剂及配制60
• 1.4 主要的仪器设备60-61
• 2 方法61-62
• 2.1 重组减毒鼠伤寒沙门氏菌c8276△crp/cya鸭瘟DNA疫苗口服剂量的确定61
• 2.2 动物免疫及样品采集61
• 2.3 差速离心配合蔗糖垫底的方法纯化DEV病毒颗粒61
• 2.4 包被抗原及阳性样品最佳稀释度的确定61-62
• 2.5 ELISA检测特异性抗tUL24蛋白及DEV的抗体水平应答62
• 2.6 攻毒保护试验62
• 3 结果62-69
• 3.1 重组减毒鼠伤寒沙门氏菌c8276△crp/cya鸭瘟DNA疫苗的口服免疫62-63
• 3.2 鸭瘟病毒的细胞培养及纯化63-64
• 3.3 最佳抗原及最佳样品稀释度的确定64-65
• 3.4 间接ELISA检测血清抗tUL24蛋白和DEV的IgY滴度65-66
• 3.5 间接ELISA检测胆汁中抗tUL24蛋白和DEV的IgA滴度66-69
• 4 讨论69-72
• 4.1 检测特异性IgY和IgA抗体的意义69
• 4.2 佐剂及多抗原基因同时免疫对鸭瘟DNA疫苗体液免疫的影响69-70
• 4.3 质粒载体对鸭瘟DNA疫苗体液免疫的影响70-71
• 4.4 LTB作为黏膜佐剂在促进口服鸭瘟DNA疫苗免疫效果上的优势71-72
• 4.5 多抗原基因共免疫在诱导保护力上的优势72
• 5 小结72-74
• 参考文献74-84
• 附录 PKDNA全序列84-86
• 致谢86

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1 刘雪燕;重组减毒沙门氏菌鸭瘟病毒DNA疫苗的构建及其口服免疫效果研究[D];四川农业大学;2015年

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本文编号：1031770