从文昌鱼G6Pase基因的克

发布时间：2017-10-22 18:35

  本文关键词：从文昌鱼G6Pase基因的克隆、表达和调控探索肝脏起源

  更多相关文章： 文昌鱼 葡萄糖-6-磷酸酶 肝盲囊 肝脏 糖代谢

【摘要】：文昌鱼属于头索动物,在无脊椎动物进化到脊椎动物的进程中占据关键节点位置,是研究脊椎动物起源与进化的珍贵模式生物。先前的众多研究表明,在文昌鱼中存在类似于脊椎动物肝脏的组织被称为肝盲囊。肝脏是脊椎动物特有器官,是维持糖代谢平衡的重要场所。那么文昌鱼肝盲囊是否也具有类似的调节糖代谢功能呢?这是本文研究的主要问题。脊椎动物的葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)由三种同工酶组成,即G6Pase-Ⅰ、 G6Pase-Ⅱ和G6Pase-Ⅲ。它能催化葡萄糖-6-磷酸水解成为磷酸基和游离的葡萄糖,这个催化过程是糖异生和糖原分解的最后一个关键步骤,因此对血糖水平的调节具有十分重要的作用。目前有大量的研究针对的是脊椎动物中的葡萄糖-6-磷酸酶,但在无脊椎动物当中有关葡萄糖-6-磷酸酶的表达和调控的研究则十分有限。本文对文昌鱼(Branchiostoma japonicum)中的葡萄糖-6-磷酸酶进行了鉴定,获得了全长为2053 bp的互补脱氧核糖核苷酸序列,其中开放阅读框为1095 bp,编码364个氨基酸。通过序列比对发现此预测的蛋白序列与脊椎动物的三种G6Pase具有29.8%至39.1%的一致性,与无脊椎动物有20.4%至46.7%的一致性。虽然斑马鱼的G6Pase与文昌鱼的序列一致性只有33.6%和38.8%,但是它们的3D结构具有惊人的相似性,暗示文昌鱼G6Pase与斑马鱼G6Pase的功能也具有一定的相似性。有关进化树、基因结构分析和共线性等分析结果显示了文昌鱼G6Pase与脊椎动物的G6Pase-Ⅲ具有更密切的关系。因此,文昌鱼的G6Pase可能与脊椎动物G6Pase-Ⅲ类似,是G6Pase基因原型代表,而脊椎动物的三种G6Pase是在进化过程中经过两轮基因复制产生的。我们通过实时荧光定量聚合酶反应检测到G6Pase在肝盲囊和卵巢中大量表达,具有组织特异性表达的特点。我们也证明了文昌鱼肝盲囊和斑马鱼肝脏在经过重组斑马鱼生长激素(rzGH)处理之后G6Pase的表达量呈现上升的趋势。然后,利用rzGH进行长时间处理,发现与对照组相比,rzGU仍旧具有促进作用。总而言之,rzGH所引起的G6Pase的表达模式和趋势在文昌鱼肝盲囊和斑马鱼肝脏中是相似的。通过蛋白免疫印迹实验发现文昌鱼肝盲囊提取物和鼠肝脏提取物都能与鼠抗人的G6Pase抗体发生结合,在大约40kDa的位置形成一条与我们所预测的蛋白大小近似的条带,这证明了在文昌鱼中存在天然的葡萄糖-6-磷酸酶。然后,我们通过测定肝盲囊,肠和去除两者后的文昌鱼提取物中的G6Pase活性,来定位该酶主要的表达部位。结果显示肝盲囊中G6Pase的活性要比肠高出1.6倍,而在去除肝盲囊和肠的文昌鱼提取物中其活性极其低。随后,我们对文昌鱼进行了饥饿和投喂处理,然后剖取肝盲囊进行G6Pase活性测定,与对照相比,G6Pase的活性在饥饿状态下提高了82%,并且在摄食之后降低到原先活性的75%,而文昌鱼肝盲囊中G6Pase活性的这种变化(在投喂之后降低,饥饿处理之后升高)与脊椎动物中观测到的结果一致。总而言之,本文论述了文昌鱼葡萄糖-6-磷酸酶在结构和功能方面都与脊椎动物相似。此外,文昌鱼和斑马鱼在生长激素的刺激下G6Pase基因表现出了相似的表达模式和趋势,表明G6Pase的激素调节系统在文昌鱼中已经发生了一定的进化。这些结果都为文昌鱼肝盲囊与脊椎动物肝脏同源性并且在维持葡萄糖稳态中发挥重要作用这一推论提供了有力证据。
【关键词】：文昌鱼 葡萄糖-6-磷酸酶 肝盲囊 肝脏 糖代谢
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 文献综述12-22
• 1 文昌鱼及其生物学意义12-14
• 2 文昌鱼与脊椎动物组织器官的同源性14-16
• 2.1 哈氏窝与垂体14-15
• 2.2 内柱与甲状腺15
• 2.3 肝盲囊与肝脏15-16
• 3 葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)16-18
• 4 生长激素(GH)18-19
• 5 本文的研究目的及技术路线19-22
• 5.1 研究目的19-21
• 5.2 技术路线21-22
• 第二章 文昌鱼G6Pase基因的克隆、表达和调控22-61
• 0 前言22
• 1 实验材料22-24
• 1.1 实验试剂22-23
• 1.2 实验仪器23
• 1.3 主要溶液的配制23-24
• 2 实验方法24-44
• 2.1 总RNA的制备及cDNA的获得24-27
• 2.2 文昌鱼G6Pase基因全长序列的克隆27-35
• 2.3 文昌鱼G6Pase生物信息学分析35-37
• 2.4 文昌鱼各组织取材37
• 2.5 rzGH刺激的浓度/时间依赖性实验37-38
• 2.6 Real-time PCR检测38-40
• 2.7 文昌鱼饥饿、投喂处理和活性粗酶的提取40-41
• 2.8 Western blot41-43
• 2.9 G6Pase活力测定43-44
• 3 结果44-58
• 3.1 文昌鱼G6Pase基因全长序列的克隆44-46
• 3.2 文昌鱼G6Pase生物信息学分析46-52
• 3.3 引物特异性和扩增效率检测52-53
• 3.4 Real-time PCR检测文昌鱼G6Pase在不同组织的表达53-54
• 3.5 斑马鱼、文昌鱼处理样本中G6Pase的表达54-56
• 3.6 G6Pase在不同营养状态下的活性56-58
• 4 讨论58-60
• 4.1 文昌鱼G6Pase是脊椎动物葡萄糖-6-磷酸酶的祖先型58-59
• 4.2 文昌鱼G6Pase参与葡萄糖稳态的调节59-60
• 5 结论60-61
• 参考文献61-67
• 致谢67-68
• 作者简介68
• 发表的学术论文68

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本文编号：1079610