酿酒酵母中表达不同形式pEGF在断奶动物体内外生物学活性的比较研究

发布时间：2017-11-29 21:13

  本文关键词：酿酒酵母中表达不同形式pEGF在断奶动物体内外生物学活性的比较研究

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【摘要】：[背景]猪表皮生长因子(porcine epidermal growth factor,p EGF)作为一种重要的乳源性生长因子之一,能够刺激哺乳动物的小肠DNA合成及细胞增殖,促进肠道发育,改善肠道菌群结构,从而提高其生长性能及免疫功能等。[目的]本研究分别构建INVSc1-IE(+)(胞内表达EGF蛋白)、INVSc1-EE(+)(胞外表达EGF蛋白)及INVSc1-TE(-)(含His标签EGF蛋白)三种不同表达形式的重组酵母菌,且比较分析不同表达形式EGF蛋白在断奶SD大鼠及仔猪的体内外生物学活性,对于研发一种更适用于畜牧生产及临床医学的基因表达方式具有重要意义。[方法](1)从内江猪乳腺组织中克隆EGF基因,在综合考虑酿酒酵母密码子使用频率和表达效率的基础上,人工合成sp EGF(TAA+),Mfα-sp EGF(TAA+)及sp EGF(TAA-)全基因,构建p YES2-sp EGF(TAA+),p YES2-Mfα-sp EGF(TAA+)及p YES2-sp EGF(TAA-)表达载体并在酿酒酵母中进行表达。对重组酿酒酵母INVSc1-IE(+)(胞内表达EGF蛋白),INVSc1-EE(+)(胞外表达EGF蛋白)及INVSc1-TE(-)(含His标签EGF蛋白)的三种表达蛋白进行Tricine-SDS-PAGE电泳、蛋白质免疫印迹。(2)比较分析不同表达形式EGF对SD大鼠肠上皮细胞的体外增殖活性:随机选取60只断奶SD大鼠分成6组(每组3栏,每栏3-4只)——空白对照组(Control group)、空载体组[INVSc1(EV)]、胞内表达EGF组[INVSc1-IE(+)]、胞外表达EGF组[INVSc1-EE(+)组]、含His的EGF组[INVSc1-TE(-)]以及阳性对照组(rh-EGF),进行动物饲养试验,饲喂16天后,测定其生长性能(如,日增重、日均采食量、饲料转化率等)、肠道发育(如,绒毛高度、隐窝深度、黏膜总蛋白、DNA及RNA含量),血液理化指标(如,肌酸激酶CK及乳酸脱氢酶LDH)及免疫功能(如,Ig A、Ig G及Ig M),同时采用体外培养及RT-PCR检测重组酵母在断奶SD大鼠小肠内的存活情况。(3)在以断奶SD大鼠为模型的基础上,进一步比较分析不同表达形式EGF蛋白对猪肠上皮细胞体外增殖活性——选取120只21日龄断奶的仔猪,分成5组(每组4栏、每栏6只):对照组、空载体[INVSc1(EV)]组、INVSc1-IE(+)组、INVSc1-EE(+)组及INVSc1-TE(-)组,进行动物饲养试验,饲喂21天后,测定其生长性能(如,日增重、日均采食量及饲料转化率等)、肠道发育(如,绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度、黏膜总蛋白、DNA及RNA含量)、增殖细胞核抗原的免疫组化(PCNA)、血液理化指标(如,肌酸激酶CK、碱性磷酸酶ALP及乳酸脱氢酶LDH)及免疫功能(如,Ig A、Ig G及Ig M),同时采体外培养及RT-PCR检测重组酵母在断奶仔猪小肠内的存活情况。(4)在断奶仔猪的21天试验中,分别取不同处理组的断奶仔猪在0、7、14及21天的粪便,以变性梯度凝胶电泳(DGGE)检测技术测定其16S r DNA的V3区菌群,全收粪测定饲粮养分表观消化率(如,粗蛋白、粗脂肪、粗纤维及总能等)。(5)测定不同处理组断奶仔猪的十二指肠、空肠和回肠粘膜中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、蔗糖酶(Sucrase)及碱性磷酸酶(ALP)酶活性,采用荧光定量PCR检测CK、LDH、Sucarase、ALP和EGF-R基因的m RNA表达水平。[结果](1)根据RT-PCR和测序结果显示,成功地构建了p YES2-sp EGF(TAA+)、p YES2-Mfα-sp EGF(TAA+)和p YES2-sp EGF(TAA-)三种不同表达形式的载体,并在酿酒酵母中成功表达。在Tricine-SDS-PAGE电泳及蛋白质免疫印迹中可以分别观察到目的条带及印迹条带,且在纯化定量分析中,重组酿酒酵母INVSc1-IE(+)、INVSc1-EE(+)及INVSc1-TE(-)菌液中目的蛋白表达量均为30mg·L-1。(2)SD大鼠的体外生物学活性检测结果显示,胞内和胞外表达EGF蛋白较含His标签EGF蛋白对鼠肠上皮细胞的增殖作用更显著(P0.05);断奶SD大鼠体内生物学活性检测的结果证实,胞内EGF蛋白、胞外EGF蛋白以及含His标签EGF蛋白较对照组和空载体组能显著地促进其小肠发育(如绒毛高度、隐窝深度、小肠粘膜总蛋白、总DNA及RNA含量)(P0.01),且也显著提高其生长性能(如日增重及饲料转化率)(P0.05),降低血液中肌酸激酶及乳酸脱氢酶含量(P0.05),增强其机体的免疫功能(如Ig A、Ig G及Ig M)等(0.05P0.10);进一步比较不同表达形式在断奶SD大鼠的体内外生物学活性,胞内表达EGF蛋白较胞外表达EGF蛋白及含His标签EGF蛋白能更显著地促进小肠发育,降低肌酸激酶及乳酸脱氢酶水平,提高机体免疫功能和生长性能(P0.05);重组酵母能够存活于断奶SD大鼠肠道内并能被有效分解利用。(3)据断奶仔猪的体外生物学活性检测结果,胞内表达EGF蛋白和胞外表达EGF蛋白较含His标签EGF蛋白对猪的肠上皮细胞增殖作用更为显著(P0.05);断奶仔猪体内生物学活性检测的结果所示,胞内EGF蛋白、胞外EGF蛋白以及含His标签EGF蛋白也能促进小肠发育(如绒毛高度、隐窝深度、小肠粘膜总蛋白、总DNA及RNA含量)(P0.01),显著提高其生长性能(如日增重及饲料转化率)(P0.05),降低血液中肌酸激酶及乳酸脱氢酶水平(P0.01),刺激增殖细胞核抗原阳性细胞数量(P0.01),增强其机体的免疫功能(如Ig A、Ig G及Ig M)等(0.05P0.10);此外,胞内表达EGF蛋白较胞外表达EGF蛋白及含His标签EGF蛋白能明显促进其小肠发育,降低血液中肌酸激酶及乳酸脱氢酶水平,提高机体的免疫功能和生产性能(P0.05);重组酵母能够存活于断奶仔猪肠道内并能被有效分解利用。(4)根据DGGE技术检测16S r DNA的V3区菌群结果,重组酵母组[如,INVSc1-EE(+)、INVSc1-TE(-)及INVSc1-IE(+)]的优势菌群较对照组和空载体组更明显且趋于稳定;重组酵母组较对照组和空载体组显著提高断奶仔猪对饲粮养分的表观消化率(能量、粗蛋白、粗脂肪和粗纤维)(P0.05);进一步比较三种不同表达的EGF蛋白的对饲粮养分消化率及肠道菌群结构的影响,胞内表达EGF蛋白组的其养分消化率更高(P0.05)且肠道微生态环境中的优势菌群更趋于稳定。(5)与对照组和空载体组相比,重组酵母组能显著提高断奶仔猪小肠各段(十二指肠、空肠及回肠)粘膜上的CK、LDH、Sucrase及ALP酶的酶活力(P0.05),并显著提高其CK、LDH、Sucrase、ALP及EGF-R等基因的m RNA表达水平(P0.05);此外,INVSc1-IE(+)组(胞内表达EGF蛋白)较胞INVSc1-EE(+)组(胞外表达EGF蛋白)及INVSc1-TE(-)组(含His标签EGF蛋白)也能显著提高CK、LDH、Sucrase及ALP等酶的酶活力(P0.05)及CK、LDH、Sucrase、ALP和EGF-R基因的m RNA表达水平(P0.05)。[结论]本研究成功构建的重组酿酒酵母INVSc1-IE(+)、INVSc1-EE(+)及INVSc1-TE(-)表达的EGF重组蛋白具有高生物学活性,且表达量为30mg·L-1。胞内表达EGF蛋白较胞外表达EGF蛋白及含His标签EGF蛋白在断奶SD大鼠及仔猪的体内外具有更高的生物学活性,且更适用于畜牧生产及临床医学。
【学位授予单位】：西南民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.2

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本文编号：1238137