miR-432-5p在徐淮山羊不同组织中的表达分析及功能研究

发布时间：2017-12-08 13:35

本文关键词：miR-432-5p在徐淮山羊不同组织中的表达分析及功能研究

【摘要】：micro RNAs(miRNAs)是一类高度保守的单链非编码小RNA,长度约为21~25nt,其本身不编码蛋白,但可以通过靶向抑制或降解mRNA的表达来调节生命活动。miRNA在生物体内广泛分布,可以调控骨骼肌的增殖和分化。实验室前期山羊骨骼肌转录组测序结果表明,miR-432-5p在山羊骨骼肌中表达丰度较高,推测其可能对骨骼肌的生长发育有调控作用。因此本实验选取miR-432-5p为研究对象,深入探究其对骨骼肌生长发育的影响,对miR-432-5p在徐淮山羊胎羊和成年羊2个发育时期,不同组织中的表达谱进行分析;构建miR-432-5p的过表达载体pcDNA3.1(+)-miR-432-5p,将miR-432-5p过表达载体、miR-432-5p mimics、negative control(NC)、miR-432-5p inhibitors和anti-negative control(Anti-NC)分别转染到C2C12细胞中,利用RT-qPCR和Western blot技术检测细胞增殖标志基因和分化标志基因的表达量,探究miR-432-5p对C2C12细胞增殖和分化的影响;使用预测软件预测miR-432-5p的靶基因,从中筛选出4个,构建双荧光素酶报告基因载体来验证其与miR-432-5p的靶向关系。本实验主要结果如下:1.miR-432-5p在徐淮山羊不同发育时期、不同组织的表达谱分析分析miR-432-5p在徐淮山羊不同发育时期、不同组织中相对表达量可知,在胎羊个体中,miR-432-5p在腿肌中的相对表达量最高,其次是背最长肌;而在成年羊个体中,心肌和腿肌是表达量最高的两个组织;并且miR-432-5p在胎羊肌肉组织中的表达量显著高于成年羊。表明miR-432-5p的表达不仅具有组织差异性,还有明显的发育时期差异性。2.pcDNA3.1(+)-miR-432-5p的构建与验证扩增miR-432-5p前体序列,利用双酶切法将其连接到质粒pcDNA3.1上,将构建好的过表达载体转染293T细胞,利用RT-qPCR技术检测miR-432-5p的相对表达量,与对照组相比,实验组中miR-432-5p的表达量显著上调。结果表明,pcDNA3.1(+)-miR-432-5p载体可以在细胞中高效表达,可用于后续实验。3.miR-432-5p促进C2C12细胞增殖RT-qPCR检测发现,在正常生长状态下,miR-432-5p和Ki67的表达量是随着细胞增殖逐步上升的,推测miR-432-5p对C2C12细胞增殖有促进作用。为了验证这一推论,本实验将pcDNA3.1(+)-miR-432-5p、miR-432-5p mimics、negative control(NC)、miR-432-5p inhibitors、anti-negative control(Anti-NC)分别转染到C2C12细胞中。结果发现,过表达miR-432-5p后Ki67 mRNA和蛋白质的表达都显著上升,表明miR-432-5p促进了Ki67基因的表达;转染miR-432-5p inhibitors抑制内源性miR-432-5p的表达后发现,细胞增殖标志基因的K i67的表达量显著下调,表明miR-432-5p可以促进C2C12细胞增殖。4.miR-432-5p抑制C2C12细胞分化将pcDNA3.1(+)-miR-432-5p、miR-432-5p mimics、negative control(NC)、miR-432-5p inhibitors和anti-negative control(Anti-NC)转染到C2C12细胞中,用含2%马血清培养基诱导C2C12分化,用显微镜观察不同处理情况下细胞生长状态和形态的变化,提取细胞RNA和总蛋白,分别采用荧光定量PCR和Western blot检测细胞分化标志基因MyoG、Myf5、Mef2c mRNA和蛋白质的表达量。形态观察发现,在培养第4 d,C2C12细胞有明显的肌管形成;荧光定量PCR和Western blot检测发现,过表达miR-432-5p后细胞中分化标志基因MyoG、Myf5、Mef2c mRNA和蛋白质的表达量显著下调。而转染了miR-432-5p inhibitors后,MyoG、Myf5和Mef2c的表达量显著上升,表明miR-432-5p抑制C2C12细胞分化。5.miR-432-5p靶基因预测及验证利用在线预测软件Targetscan预测miR-432-5p靶基因,由于数据库中还没有山羊的序列,所以用近源物种牛的mRNA:miRNA互作关系进行预测,再对预测得到的候选基因用DAVID在线软件进行基因注释,筛选可能对肌肉细胞增殖发育有影响的基因作为进一步研究对象。初步筛选了4个靶基因:SORT1、TGFBR2、GJC1、BCL2。构建这4个潜在靶基因的野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体,分别与miR-432-5p mimics共转染到293T细胞中,根据荧光值的变化,鉴定SORT1、TGFBR2是miR-432-5p的靶基因。为了进一步验证SORT1、TGFBR2基因miR-432-5p的靶向关系,将miR-432-5p mimics、negative control(NC)分别转染至C2C12细胞中,western blot结果同样表明SORT1、TGFBR2是miR-432-5p的靶基因。
【学位授予单位】：江苏师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S827;Q78

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