芸薹生链格孢（Alternaria brassicicola）AbSte12基因的鉴定及功能研究

发布时间：2017-12-15 13:13

  本文关键词：芸薹生链格孢（Alternaria brassicicola）AbSte12基因的鉴定及功能研究

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【摘要】：芸薹生链格孢(Alternaria brassicicola)对环境与寄主有很强的适应性,广泛分布于自然界中,常引起十字花科蔬菜黑斑病,造成严重的经济损失。此外,芸薹生链格孢也是世界上许多地区的气源性致病源,已经成为日益公认的导致哮喘、致命性哮喘恶化的危险因素。早期研究显示,FUS3/KSS1-MAPK信号途径在芸薹生链格孢致病过程中起到重要的调控作用,但对于其下游转录因子STE12的功能、作用机理及调控基因尚不清楚。本研究主要以芸薹生链格孢菌(A.brassicicola)为对象,通过构建AbSte12基因缺失突变体(ΔAbSte12)、AbSte12基因互补体(C),与野生菌(Wild-type,WT)对比研究,进而深入了解转录因子STE12的生物学功能,分析其下游靶标基因,探索其调控机制。主要结果如下:1.AbSte12基因的生物信息学分析。以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Ste12(NP_011952.1)和大麦网斑病菌(Pyrenophora teres f.teres)的一个同源基因(XP_003303640.1)为查询,在已构建的芸薹生链格孢基因组数据库中进行本地比对,找到A.brassicicola中Ste12的同源基因,命名为AbSte12。设计特异性引物从芸薹生链格孢菌中成功扩增AbSte12基因DNA及cDNA,该基因全长2364bp,含有3个内含子,cDNA 2091bp,编码696个氨基酸。DNAMAN分析显示Ab Ste12与不同Ste12-like基因氨基酸序列具有很高的同源性。通过SMART预测网站对A.brassicicola Ste12氨基酸序列进行分析,发现该基因与其他多数Ste12-like基因编码的氨基酸序列N末端都具有典型的Ste-homolog结构域,C末端包含两个C2H2的锌指结构域,而后者在酿酒酵母中不存在。利用MEGA6.0分析不同Ste12-like基因系统进化关系,显示A.brassicicola AbSte12与灰葡萄孢(Botrytis cinerea)Ste12、菌核雪腐病菌(Sclerotinia borealis)Ste12亲缘关系最近。2.ΔAbSte12突变体的构建。构建AbSte12打靶载体A+M+B,获取A.brassicicola原生质体并通过PEG介导进行转化,在含有潮霉素的培养基上筛选出转化子,设计特异性引物通过普通PCR验证筛选,得到ΔAbSte12突变体。此外,通过Southern杂交技术验证为潮霉素磷酸转移酶基因单拷贝插入ΔAbSte12突变体。3.AbSte12基因的功能研究。在菌落表型、分生孢子的形成、致病力以及菌丝穿透能力等方面对比分析ΔAbSte12突变体与野生菌的差异。结果发现ΔAbSte12突变体在PDA培养基上生长速度减缓且不能产生成熟分生孢子。采用离体叶片接种法接种油菜叶片,ΔAbSte12突变体不能侵染叶片组织,致病力丧失。此外,利用覆有灭菌玻璃纸的PDA的培养基培养ΔAbSte12突变体及野生菌,发现ΔAbSte12突变体不能穿透玻璃纸再次生长。构建互补体后,其生物学性状等均恢复到野生菌水平。由此可以推测,在芸薹生链格孢菌中,AbSte12基因参与调控菌丝营养体生长、分生孢子的形成、穿透力以及致病性。4.AbSte12基因下游部分调控基因的鉴定。利用Real time PCR技术对ΔAbSte12突变体及野生菌cDNA进行对比分析,结果初步证实转录因子Ab Ste12的部分下游调控基因为AbBud8、Ab Bem1、AbPck1、Ab Chs7、AbSho1、AbPrm2。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S432.4

【参考文献】

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本文编号：1292074