刚地弓形虫ME49株含信号肽DNase的表达与功能分析

发布时间：2018-01-10 08:07

  本文关键词：刚地弓形虫ME49株含信号肽DNase的表达与功能分析　出处：《吉林大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：刚地弓形虫是顶复门寄生的原虫,能够感染人和哺乳动物的几乎所有有核细胞。刚地弓形虫病是一种典型的人兽共患病,在世界上几乎有1/3人感染这种寄生虫病[1]。人类和动物主要通过摄入具有感染性的卵囊,或者被污染的水或食物而感染,正常人群感染后通常呈隐性感染,但是在免疫受损的个体,例如在器官移植、艾滋病、癌症患者体内,潜伏感染的刚地弓形虫经过再次活化能够对机体带来致命的损伤。目前对于治疗急性感染的刚地弓形虫病的药物有乙胺嘧啶和磺胺嘧啶,但是这类药物具有很强的毒副作用。信号肽是协助新合成的蛋白质向分泌通道转移的肽段,大部分存在于N-端,包含5-30个氨基酸。脱氧核糖核酸酶(Deoxyribonuclease)简称DNase,是催化DNA主链中磷酸二酯键的裂解,从而降解DNA的酶,同时也是参与DNA的复制、重组和修复的重要蛋白质。一些DNA酶只切割DNA分子末端的残基称为脱氧核糖核酸外切酶,例如寡核苷酸酶。而能够从DNA内部切割的酶称为脱氧核糖核酸内切酶,例如DNaseⅠ、DNaseⅡ。目前研究发现利什曼虫和布氏锥虫中的DNase能够通过切除受损或错配的碱基,从而对DNA进行修复,但是关于刚地弓形虫DNA的加工降解机制研究较少。因此本实验中,选取了两个DNase基因进行研究。首先对两个DNase序列基因进行分析,选取亲水性区域扩增构建重组表达质粒,在大肠杆菌原核表达系统中进行重组蛋白质的表达纯化。纯化的His标签重组蛋白质免疫家兔制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光和Western-blot方法对天然蛋白质进行定位和表达研究。然后通过生物信息学分析选出两个DNase的功能区,进行GST标签重组蛋白质的表达和纯化。然后在体外进行DNA降解实验,并通过加入二价金属离子来检测DNase的离子依赖性。研究结果分析显示制备的兔抗His标签重组蛋白抗体效价均1∶16000,Western blot方法验证显示抗体能识别天然DNase蛋白质。间接免疫荧光结果显示TGME49-204410、TGME49-216600均定位在细胞质,而且靠近细胞膜。体外DNA降解实验及离子依赖性实验表明TGME49-204410和TGME49-216600均表现出Cu2+依赖性的脱氧核糖核酸内切酶的活性。这将为进一步探索DNase在刚地弓形虫体内的功能和对刚地弓形虫病的预防和治疗奠定基础。
[Abstract]:Toxoplasma gondii is a parasitic protozoan that can infect almost all of the nucleated cells in humans and mammals . Toxoplasma gondii is a typical zoonotic , almost 1 / 3 of the world infected with this parasitic disease . DNA degradation experiments and ion - dependent experiments show that both TGME49 - 204 410 and TGME49 - 216600 can express Cu2 + - dependent DNA . The results show that TGME49 - 204 410 and TGME49 - 216600 can be used for DNA degradation .

【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.7

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本文编号：1404479