三疣梭子蟹ABCG转运蛋白对氟苯尼考代谢作用的研究

发布时间：2018-02-28 03:12

本文关键词： 氟苯尼考三疣梭子蟹 ABCG转运蛋白基因克隆解毒代谢　出处：《大连海洋大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：ABCG(ATP-binding cassette transporter G)转运蛋白是ABC家族转运子的一个成员,是一类跨膜转运蛋白,通过水解ATP的能量对胞质中的外源化合物、代谢产物、离子、糖、氨基酸、脂类等物质进行跨膜转运。本文以我国渔用抗生素的使用情况为依据,以甲壳类重要养殖品种三疣梭子蟹为研究对象,以养殖过程中常用抗生素——氟苯尼考(FLR)为代表,采用ABCG蛋白特异性抑制剂——烟曲霉毒素C(FTC)对比研究了氟苯尼考在三疣梭子蟹重要组织中的分布及消除情况;首次克隆了三疣梭子蟹ABCG蛋白基因,并测定了氟苯尼考的解毒代谢相关酶及相关基因的表达,并且初步研究了FLR对三疣梭子蟹免疫和抗氧化系统的影响。得到如下结果:1.ABCG蛋白对氟苯尼考转运活力的测定为检测三疣梭子蟹ABCG转运蛋白对氟苯尼考转运活力的大小,本实验通过注射ABCG转运蛋白特异性抑制剂——FTC,比较有无抑制剂对三疣梭子蟹组织中氟苯尼考累积及消除的变化。结果表明,在40 mg/kg氟苯尼考剂量下,药物在体内的累积阶段,注射抑制剂FTC组的氟苯尼考在肝胰腺、肌肉、鳃和血淋巴中的累积量均高于无抑制剂组,达峰时间晚。药物消除阶段,抑制剂组消除速度比无抑制剂组缓慢一些,在血淋巴、肝胰腺、肌肉和鳃中的药物消除半衰期(t1/2)分别是0.85、1.25、1.91、1.35 h,而无抑制剂组对应的消除半衰期为0.80、1.00、1.72、1.73 h,由此表明三疣梭子蟹ABCG转运蛋白促进了氟苯尼考的转运代谢。从各组织ABCG转运蛋白的活力来看,血淋巴、肝胰腺、肌肉和鳃组织分别在3、3、3、6 h达到最大值,然后逐渐降低。转运活力的大小与各组织中氟苯尼考的累积量相对应,进一步证明了三疣梭子蟹ABCG转运蛋白对氟苯尼考的转运作用。2.氟苯尼考对三疣梭子蟹不同组织中ptABCG基因表达量的影响为深入研究ABCG转运蛋白在氟苯尼考代谢过程中的作用,采用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹ABCG的全长cDNA序列,命名为ptABCG(GenBank登录号:KY242401)。该基因全长2473 bp,包括1747 bp的开放阅读框(ORF),25 bp的5’非编码区(5’UTR)和701bp的3’非编码区(3’UTR)。结构功能域分析显示,该蛋白具有半转运子ABCG转运蛋白的基本结构特征,含有1个疏水性的跨膜区(transmembrane domain,TMD)和1个核苷酸结合区(nucleotide binding domain,NBD);存在由内向外和由外向内的2种跨膜螺旋,因此可判断获得的cDNA序列是三疣梭子蟹ABCG转运蛋白基因序列。采用RT-PCR法,从mRNA水平分析氟苯尼考对三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉、鳃中ptABCG表达的影响。结果显示,40mg/kg剂量下,3 h前FTC+FLR组各组织中ptABCG的相对表达水平受到抑制,显著低于FLR组(P0.05),随着抑制剂作用的减弱表达水平迅速提高,肝胰腺、肌肉、鳃中的表达量分别于12、6、12 h达到峰值,且高于FLR组,最终两组的表达都趋于对照水平。此实验结果从基因水平表明了三疣梭子蟹ABCG转运蛋白在氟苯尼考的转运代谢中发挥着一定的作用。3.氟苯尼考对三疣梭子蟹解毒代谢途径的影响研究为研究氟苯尼考在三疣梭子蟹体内的解毒代谢途径,测定了I相解毒代谢酶(APND)、II相解毒代谢酶(GST)的活性及对应基因CYP2、GST和Ⅲ相代谢ABCG基因的相对表达。结果表明,氟苯尼考对三疣梭子蟹各相酶活力及基因表达的影响显著(P0.05),且呈时间-剂量效应,对照组则无明显变化。氟苯尼考对肝胰腺、血淋巴APND及CYP2 mRNA表达具有抑制作用,于6 h达最低值,随后逐渐恢复至对照组水平;对肝胰腺GST活性及GST mRNA表达呈诱导作用,且呈现高剂量组中剂量组低剂量组。对血细胞中GST mRNA表达的影响与药物浓度有关,低、中剂量组诱导GST mRNA表达,而高剂量组的表达活受到抑制,于6 h时显著低于对照组(P0.05)。不同浓度氟苯尼考对三疣梭子蟹肝胰腺、鳃、肌肉ABCG mRNA的表达均具有诱导作用,呈现先升高后降低的趋势,并有一定的时间剂量效应。由此推断,ABCG蛋白的转运作用随着药物及代谢产物在体内的累积而增强,并且及时将其排出体外,以防对生物体造成损伤。4.氟苯尼考对三疣梭子蟹生理健康指标的影响为研究氟苯尼考对三疣梭子蟹生理健康的影响,对免疫效应和抗氧化防御两个方面的主要指标进行检测,结果表明:与对照组相比,氟苯尼考对三疣梭子蟹免疫系统中的抗菌和酚氧化酶活力具有显著的抑制作用(P0.05),且各剂量组出现一定的时间和剂量效应;对溶菌活力的变化则无显著影响(P0.05)。氟苯尼考对三疣梭子蟹肝胰腺、血淋巴中的总抗氧化能力(T-AOC)、SOD活力、GSH活性均产生显著影响(P0.05),肝胰腺中T-AOC、SOD、GSH分别于6、6、12 h达到最低值,血淋巴中于3、3、6 h达到最低值,之后随时间延长,低(20 mg/kg)、中(40 mg/kg)剂量组各抗氧化指标逐渐恢复至对照组水平,而高(80mg/kg)剂量组的活性在实验结束时仍处于抑制状态。因此,氟苯尼考对三疣梭子蟹免疫和抗氧化系统影响显著,用于防治疾病的时要综合考虑药物剂量对其生理健康的影响。
[Abstract]:In this paper , we studied the distribution and elimination of fluorophrinin in Portunus trituberculatus by using ABCG protein - specific inhibitor _ FTC . The results showed that the elimination half - life ( t1 / 2 ) of the ABCG protein in the liver , pancreas , muscle and gill was 0 . 85 , 1 . 25 , 1 . 72 and 1 . 73 h . The results showed that the relative expression level of pABCG was significantly lower than that in the FLR group ( P0.05 ) . The results showed that the expression levels of pABCG were significantly higher in the three hours before and after 3 h . The results showed that the expression of the mRNA in the liver , pancreas , muscle and gill was higher than that of the FLR group . The results showed that the expression of GST mRNA in the liver and pancreas was significantly lower than that in the group of the control group . The results showed that the anti - oxidation ability ( T - AOC ) , superoxide dismutase ( SOD ) and GSH ( GSH ) activity of Portunus trituberculatus ( Portunus trituberculatus ) were significantly inhibited ( P0.05 ) .

【学位授予单位】：大连海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S948

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