禽白血病病毒p27抗原不同检测方法在禽白血病净化中的应用与比较

发布时间：2018-03-16 04:24

  本文选题：禽白血病　切入点：泄殖腔棉拭子　出处：《山东农业大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：禽白血病(Avian Leukemia,AL)是我国鸡群中流行最为广泛的肿瘤性疾病之一。其病原体是禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)。自1908年首次报道禽白血病以来,世界各地不断有该病的报道流行。现今,我国鸡群中普遍存在ALV感染,尤其在我国地方品种鸡中感染率较高,对地方品种资源造成严重威胁的同时,也给家禽养殖业带来巨大经济损失,因而对ALV的监测和净化越来越受到业界的关注。目前,对待检鸡群进行病毒分离或者通过检测不同样品中p27抗原确定阳性个体进而淘汰是ALV净化过程中不可或缺的重要措施。在净化的过程中,选择何种样品和何种检测手段来确定感染的鸡只进行淘汰是实施净化进而精简净化程序的核心,本研究不仅对应用ALV-p27抗原的单克隆抗体进行间接免疫荧光(IFA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)进行了对比,也对感染鸡群中同一样品的病毒分离及其泄殖腔棉拭子或蛋清p27抗原检测进行了系统对比,以期为科学设定ALV净化检测规程提供技术指导。1.不同类型鸡其泄殖腔棉拭子或蛋清p27抗原检测与病毒分离相关性分析为探讨泄殖腔棉拭子或种蛋中ALV-p27抗原检测与病毒分离检测之间的相关性,本研究对几种不同类型鸡群,包括不同方式人工接种A亚群ALV的SPF鸡、完成ALV净化的进口祖代肉鸡以及处于ALV净化过程中的绿壳蛋鸡、琅琊鸡、仙居鸡、芦花鸡4个地方品系鸡,对其进行一一编号后分别对应采集泄殖腔棉拭子或蛋清用ELISA抗原检测试剂盒检测p27抗原,同时无菌采集抗凝血接种DF-1细胞进行ALV的分离鉴定,来观察和比较泄殖腔棉拭子或种蛋中ALV-p27抗原检测与病毒分离检测之间的吻合率。结果显示,人工感染A亚群ALV的SPF鸡群泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原检测与病毒分离有很高的吻合率,相对于病毒分离法,119次泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原检测中出现有1例假阳性和3例假阴性;从美国进口的200只祖代肉鸡3次采血DF1细胞病毒分离结果均为阴性,而泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原阳性率依次为4.0%(8/200),2.97%(5/168)和2.61%(4/153),平均假阳性率为3.3%(17/521)。相对于病毒分离法,正在实施ALV净化的不同遗传背景地方品系鸡泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原检测的假阳性率高达93.2%~100%,还有一定比例假阴性(1/9,1/4,1/3)。本研究大量一一对应比较的数据表明,相对于血浆病毒分离法,不同类型鸡的泄殖腔棉拭子p27检测法不仅有很高的假阳性率,还有一定比例漏检率。在种鸡场的ALV净化过程中考虑到成本,不建议以泄殖腔棉拭子作为检测材料。本研究将为我国鸡群中禽白血病的净化检测和临床鉴别诊断提供参考依据。2.针对p27蛋白的ELISA与IFA检测不同亚群ALV的灵敏性比较为了评估以p27单克隆抗体(4F12腹水)进行的IFA检测与p27抗原的ELISA检测的灵敏性,本研究将A亚群SDAU14A1株、B亚群SDAU09C2株、J亚群733株及K亚群JS11C1株和JS11C3株四种不同ALV亚群五个毒株分别以细胞维持液做10倍有限梯度稀释(10-1~10-8),每个稀释度各取100μL接种于96孔细胞培养板的一列DF-1细胞共8个孔,接种2 h后换液维持。每个毒株做3个重复,分别在3、6、9 d对细胞培养上清p27抗原进行ELISA检测,细胞固定进行IFA检测,Reed-Muench法计算两种方法测定的病毒TCID50。结果显示,IFA检测A、B、J、K各个ALV亚群感染的DF-1细胞时,荧光显微镜下均出现特异性绿色荧光信号,而对照组无荧光显现;与ELISA检测结果相比,IFA检测不同ALV亚群时均可检测到更高的病毒稀释度和更多的阳性细胞孔;采用Reed-Muench法计算所得ELISA和IFA两种检测方法测定的各个病毒毒株TCID50分别是SDAU14A1株10-4.33 TCID50/0.1 m L与10-4.80 TCID50/0.1 m L、SDAU09C2株10-4.50 TCID50/0.1 mL与10-5.43 TCID50/0.1 mL、733株10-5.20 TCID50/0.1 m L与10-5.43TCID50/0.1 m L、JS11C1株10-4.80 TCID50/0.1 mL与10-5.20 TCID50/0.1 mL、JS11C3株10-4.67TCID50/0.1 mL与10-5.33 TCID50/0.1 mL,可以看出,IFA测定的病毒TCID50均明显高于ELISA。本研究结果证明p27单克隆抗体4F12腹水能够特异性结合A、B、J、K亚群ALV p27蛋白,以其进行的IFA检测具有比ELISA检测p27抗原更高的灵敏性。本研究建立的评估方法为禽白血病的种群净化特别是对ALV检测试剂盒的选择标准提供了更多技术参考。
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【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S858.31

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本文编号：1618325