牛源A型多杀性巴氏杆菌PM0979蛋白的功能研究

发布时间：2018-03-17 12:09

本文选题：牛　切入点：多杀性巴氏杆菌　出处：《西南大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)为球杆状或短杆状的革兰氏阴性菌,根据荚膜抗原主要分为A、B、D、E和F 5种荚膜血清型,根据菌体抗原分为1~16个血清型。多杀性巴氏杆菌能够引起牛羊等多种动物的感染,导致急慢性传染性疾病,其症状包括牛出血性败血症、牛肺炎、猪肺疫、猪萎缩性鼻炎、禽霍乱、兔出血性败血症等。已有文献报道,人被犬猫抓伤后感染多杀性巴氏杆菌可引起局部组织损伤,甚至导致全身系统性疾病。该病不仅严重威胁动物及人类的身体健康,也给养殖业带来巨大的经济损失。近年来,随着肉牛养殖的发展,牛多杀性巴氏杆菌病的流行呈现上升趋势,而牛群感染大多以A型多杀性巴氏杆菌所致的牛肺炎为主。多杀性巴氏杆菌毒力因子在致病机制中占有至关重要的作用,如粘附素、荚膜、脂多糖、外膜蛋白、铁调控蛋白和毒素等。外膜蛋白是外膜中镶嵌的多种蛋白质的总称,脂蛋白是外膜蛋白的一种,具有粘附宿主、抵御毒素入侵、影响生物膜形成等作用,在细菌对宿主的感染和致病过程中起着重要的作用。根据报道,脂蛋白E(PlpE)作为重要的毒力因子,具有较好的免疫原性,可作为良好的疫苗候选。实验室前期研究发现,PM0979蛋白可能是细胞膜的组成成分,且其重组蛋白具有较好的免疫原性,但目前对其功能的研究尚不清楚。本研究首先通过生物信息学软件分析PM0979的蛋白结构和可能的细胞定位;同时,采用荧光定量PCR检测Pm0979基因的体内外表达情况。其次,通过间接免疫荧光分析其细胞定位。最后,通过体外实验研究其刺激巨噬细胞产生炎症细胞因子的能力;同时,以A型多杀性巴氏杆菌为研究对象,构建Pm0979基因的突变株,并通过体内实验初步探究其功能。1.多杀性巴氏杆菌pm0979基因的生物信息学及体内外表达差异分析本试验利用SignalP-4.1 server及TMHMM Server v2.0在线分析软件对PM0979进行信号肽和跨膜结构域的生物信息学分析,结果显示,PM0979蛋白的1-20aa为信号肽区域,无跨膜结构域;利用DOLOP在线分析程序以及LipoP 1.0server在线分析软件对PM0979蛋白进行脂蛋白的预测分析,预测其为假定的脂蛋白;利用CELLOv.2.5在线分析软件进行Pm0979基因细胞定位的预测,预测结果该蛋白定位在细胞膜与外膜之间;利用Clustalx1.83分析软件进行Pm0979基因的同源性分析比较,结果显示,基因Pm0979在A型菌株和B型菌株中保守性极高,在D型菌株、F型菌株和羊源菌株中存在单碱基的突变,提示PM0979蛋白定位在胞外且与巴氏杆菌多种血清型菌株同源性高。在以上结果基础上,以本实验室不同血清型菌株PmA、PmB、PmF为模板,通过荧光定量PCR检测Pm0979基因的体外表达情况。结果显示,Pm0979基因在PmA、PmB、PmF型菌株的体内外均表达且有一定差异。2.Pm0979基因的原核表达及其蛋白的细胞定位分析通过设计引物PCR扩增PmCQ2菌株的Pm0979基因,以PET-32a(+)为载体构建重组质粒,IPTG诱导表达重组蛋白rPM0979。通过超声波破碎菌体后保留上清,进行SDS-PAGE检测及可溶蛋白rPM0979的纯化除盐,制备rPM0979的小鼠血清抗体。以PmCQ2为研究对象,通过间接免疫荧光试验(IFA)检测PM0979蛋白在PmCQ2菌株中的分布特征。结果显示透化组的PmCQ2呈现翠绿色荧光信号,未透化组和阴性组的PmCQ2没有任何信号,表明rPM0979抗体能够特异地识别Pm细胞壁内的抗原,并与之发生免疫反应,推测该蛋白可能分布于细菌的膜上。3.多杀性巴氏杆菌PM0979致病性研究分离培养小鼠腹腔巨噬细胞,并将可溶蛋白rPM0979与巨噬细胞共培养24h,通过ELISA检测TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-18炎性细胞因子。结果显示,rPM0979诱导巨噬细胞后TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-18炎性细胞因子均上调,TNF-α、IL-6及IL-18的上调与对照组相比差异极显著,IL-1β差异显著。该结果提示PM0979可能参与多杀性巴氏杆菌致炎作用。以PmCQ2基因组为模板PCR扩增Pm0979基因的上下游同源臂,将其克隆至质粒PUC19ori KanR相应的酶切位点,构建重组转移质粒PUC19oriKanR-△0979。将重组转移质粒电转化至感受态中,在抗性培养基上进行筛选,PCR检测及Western blot验证,构建PmCQ2菌株的Pm0979基因突变株。检测突变株对生化试验,生长曲线,生物膜形成的影响。结果显示,PmCQ2-△0979突变株与野毒株PmCQ2的生化特性一致;体外37℃培养,PmCQ2-△0979突变株生长速度与野毒株PmCQ2无差异;值得注意的是,PmCQ2-△0979突变株生物膜形成能力减弱;同时,通过体内及体外实验检测PM0979对巴氏杆菌毒力的影响,动物攻毒试验显示,PmCQ2-△0979突变株腹腔攻毒小鼠后死亡率为75%,而野生型PmCQ2为100%。说明PmCQ2-△0979突变株毒力减弱;ELISA检测PmCQ2-△0979突变株感染巨噬细胞后炎症细胞因子的表达水平,结果显示相对于野生型,TNF-α、IL-1β及IL-6的表达无显著差异。该结果提示PM0979是多杀性巴氏杆菌的毒力相关因子,在多杀性巴氏杆菌的致病过程中具有一定作用。
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【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.61

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