山西省奶牛乳腺炎病原及诊断技术的研究

发布时间：2017-03-27 04:11

  本文关键词：山西省奶牛乳腺炎病原及诊断技术的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本试验通过对养牛户和规模化养牛场的1500头奶牛的调研,分析了山西省奶牛乳腺炎的发病情况以及引起该病的主要病原菌；采用PCR等分子生物学手段,检测研究了引起山西省奶牛乳腺炎的主要病原菌,将多病原检测的PCR检测条件予以优化筛选,对多重PCR情况进行确定,在此基础上,研究了这些微生物的特异性和敏感性。结果表明：1、调查发现了与引起山西省奶牛乳腺炎相关的病原菌9种159株细菌,经鉴定证明的这些微生物约79%是大肠杆菌、链球菌及葡萄球菌。对上述微生物进行药敏试验，结果显示,上述三种微生物对广谱抗生素多西环素(Doxycycline),以及洁霉素、左氧氟沙星、头孢曲松钠等抗菌药物呈中度或高度敏感,而对氨苄西林、链霉素或丁胺卡那霉素显示无敏感性或低敏感。2、多重PCR检测结果表明,用于扩增菌株引物的最佳浓度是：大肠杆菌的引物终浓度为0.75～1.0μmol/L,金黄色葡萄球菌引物终浓度为1.25～2.0μmol/L,无乳链球菌的引物终浓度为1.5～1.75μ/L;最适退火温度是：大肠杆菌菌株为46.3～53.3℃，金黄色葡萄球菌菌株为55.3～57.6℃,无乳链球菌菌株为49.4～55.3℃；扩增dNTP最适终浓度是：大肠杆菌为0.075～0.3mmol/L,金黄色葡萄球为0.15mmol/L,无乳链球菌为0.1～0.2mmol/L。分别将大肠杆菌标准菌株、金黄色葡萄球菌菌株以及无乳链球菌菌株用其自身引物优化后的条件进行PCR单重扩增,结果依次显示在544 bp.439bp、162bp处见有与设计一致的核酸扩增片段。3、对于大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和无乳链球菌分别用PCR检测法与细菌培养法方法鉴定出现显著差异,由此可见,对上述细菌检测的灵敏度PCR法优于细菌培养法,说明PCR更适于于奶牛场及质量检查监督单位的实际需要。综上,大肠杆菌、葡萄球菌和链球菌是造成山西省规模化奶牛场及养牛户奶牛乳腺炎的主要病原,这些微生物对多西环素(Doxycycline)、洁霉素、头孢曲松钠、左氧氟沙星敏感；PCR检测和细菌培养法均可用于金黄色葡萄球菌的鉴定,且PCR法更为灵敏、更适合奶牛场及乳品质量的检测监控。
【关键词】：奶牛 乳腺炎 病原菌 分离鉴定 多重PCR
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.23
【目录】：

• 摘要8-9
• 前言9-10
• 第一部分 文献综述10-16
• 1 国内外研究现状10-12
• 1.1 奶牛乳腺炎的研究进展10-11
• 1.2 聚合酶链式反应11-12
• 2 研究目的12
• 3 主要研究内容12-13
• 4 技术路线13
• 5 主要解决的关键技术与创新点13-14
• 5.1 关键技术13
• 5.2 存在问题和改进意见13-14
• 5.3 创新点14
• 6 取得的社会经济效益及推广应用前景14-16
• 第二部分 试验部分16-39
• 试验一 山西省奶牛乳腺炎病原菌的分离及其生物学特性的鉴定16-22
• 1 材料与方法16-17
• 1.1 试验动物16
• 1.2 主要试剂16
• 1.2.1 培养基16
• 1.2.2 药敏纸片16
• 1.3 试验方法16-17
• 2 试验结果17-20
• 2.1 山西省奶牛乳腺炎致病菌的分离鉴定17-18
• 2.2 药敏试验结果18-20
• 3 讨论20-21
• 3.1 山西省奶牛场奶牛乳腺炎致病菌的分离鉴定结果分析20
• 3.2 奶牛乳腺炎的疗效分析20-21
• 4 小结21-22
• 试验二 乳腺炎致病菌的分子生物学鉴定22-31
• 1 材料与方法22-25
• 1.1 试验菌株22
• 1.2 主要仪器及试剂22
• 1.2.1 主要仪器22
• 1.2.2 主要试剂22
• 1.3 试验方法22-25
• 1.3.1 病原体DNA提取22-23
• 1.3.2 引物的设计与合成23-24
• 1.3.3 PCR反应24
• 1.3.4 三种致病菌单重PCR的特异性试验24
• 1.3.5 三种致病菌单重PCR方法灵敏性的确定24
• 1.3.6 PCR扩增及条件优化24-25
• 2 试验结果25-29
• 2.1 PCR扩增退火温度的优化结果25-26
• 2.2 PCR扩增引物浓度的优化结果26-27
• 2.3 PCR扩增DNTP浓度的优化结果27-28
• 2.4 PCR扩增特异性结果28
• 2.5 PCR扩增敏感性结果28-29
• 3 讨论29-30
• 3.1 乳样中不同病原菌的多重PCR检测结果29-30
• 3.2 PCR引物的设计及片段扩增30
• 4 小结30-31
• 试验三 多重PCR检测与细菌培养法对乳腺炎病原诊断的效果31-39
• 1 试验材料与方法31-32
• 1.1 奶样的采集31
• 1.2 试验主要仪器及试剂31
• 1.2.1 主要仪器31
• 1.2.2 主要试剂31
• 1.3 试验方法31-32
• 1.3.1 乳样中细菌的检测鉴定31-32
• 1.3.2 药敏试验32
• 1.3.3 乳样中细菌DNA的提取32
• 1.3.4 引物的设计及PCR扩增32
• 1.4 统计学方法32
• 2 试验结果32-38
• 2.1 乳样细菌培养与多重PCR检测结果的比较32-33
• 2.2 多重PCR和细菌学培养法对3种病原菌检测结果的比较33-38
• 3 讨论38-39
• 3.1 多重PCR与细菌培养灵敏性对比38
• 3.2 多重PCR技术分析38-39
• 4 小结39
• 全文结论39-40
• 参考文献40-44
• Abstract44-46
• 致谢46

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本文编号：269843