海棠类黄酮合成调控转录因子克隆与表达分析

发布时间：2017-03-27 06:12

  本文关键词：海棠类黄酮合成调控转录因子克隆与表达分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：海棠作为园林观赏植物,在我国已有悠久的栽培历史。近年来,在育种研究者的不懈努力下,海棠新品种不断增多,其在叶色、花色、果色、花期、果期、树形等方面产生了许多变化。在现代园林中,观赏海棠由于其观赏特性的极大丰富,逐渐成为了主要的园林造景植物之一。参与植物花色、叶色形成的主要物质之一是植物体内的类黄酮化合物。本实验通过对红色叶‘王族’海棠类黄酮合成途径中的MYB、bHLH、WD40三类转录因子的克隆与表达分析,以及对3种不同叶色观赏海棠的3个时期叶片进行类黄酮含量测定和相关结构基因及转录因子的表达水平,对观赏海棠的叶色形成机制以及调控途径进行了研究。研究结果如下:(1)选择红色叶‘王族’海棠为实验材料,对其嫩叶中的MYB、bHLH、WD40三类转录因子进行克隆,得到MRYMYB10(Gene Bank:KF772789)、MRYMYB6(Gene Bank:KJ026364)、MRYLC(Gene Bank:KP222538)和MRYWD40(Gene Bank:KJ542656)四个基因。对4个基因进行生物信息学分析,发现其氨基酸序列与苹果中对应基因MdMYB10(GeneBank:AB592747)、MdMYB6(GeneBank:DQ074461)、MdbHLH33(GeneBank:DQ266451)和MdTTG1(GeneBank:GU173814)的相似度分别为100%、96.79%、98.92%和99.77%。对4个蛋白的二级结构和三级结构分析结果发现:MRYMYB10蛋白和MRYMYB6蛋白均含有典型的R2R3结构并定位在细胞核,同时MRYMYB10在不同物种间同源性较高,而MRYMYB6与苹果属以外的植物同源性很低;MRYLC含有bHLH结构并最有可能定位于细胞核,同时MRYLC在同科内同源性较高,在不同科植物间同源性较低;MRYWD40具有典型的重复WD保守结构,且在不同科属植物碱的保守性极高,对其进行亚细胞定位发现其可能存在于细胞骨架,其次是细胞核。(2)选择红色叶‘王族’海棠、新叶红色‘绚丽’海棠和绿色叶‘雪球’海棠的叶片为实验材料,选取每种海棠的嫩叶期、变色叶期、成熟叶期三个不同时期的叶片进行色素含量分析,结果发现:1.海棠叶色的红色着色程度与叶片内的花青苷含量基本呈正相关关系;2.海棠类黄酮合成途径中不同支路间存在竞争底物、产物积累量此消彼长的关系;3.‘王族’海棠叶片中含有营养价值的部分酚类物质含量不同程度的多余其他两种海棠同时期叶片,且叶片中各酚类含量与叶片显红色的程度基本呈正相关。(3)对3种海棠3个时期叶片中类黄酮合成途径中相关结构基因和转录因子进行表达分析,结果显示:1.叶片花青苷积累量受ANS和FGT基因调控,但花青苷积累量与ANS基因表达量并不完全一致,而与FGT基因表达量基本一致;2.ANS基因和FGT基因表达量与MRYMYB10、MRYMYB6的相关性显著。MRYMYB10对花青素积累有正向调节作用,而MRYMYB6与MRYMYB10为竞争关系,对花青素有负向调节作用;3.MRYLC与MRYMYB10可能形成复合体,同时对FGT进行调节,从而对花青苷积累起正向调节作用,而MRYMYB6对MRYLC表达存在抑制作用;4.MRYWD40与MRYLC表达水平基本一致,可能是二者受同一因素调节,也可能是二者形成复合体,相互调节表达水平;5.MRYWD40与MRYLC形成的复合体可能直接参与花青苷合成调控,也可能与MYB蛋白形成MBW复合体,对花青苷合成进行调控;6.海棠中MRYWD40蛋白可能存在除花青苷合成途径调控功能以外的其他调控植物生长发育功能。
【关键词】：观赏海棠 类黄酮 MYB bHLH WD40 基因克隆 表达分析
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S68;Q943.2
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 第一章 文献综述12-24
• 1.1 观赏海棠研究概述12-13
• 1.1.1 观赏海棠的生物学特性12
• 1.1.2 观赏海棠的应用价值12-13
• 1.1.3 观赏海棠的研究进展13
• 1.2 植物类黄酮研究概述13-18
• 1.2.1 类黄酮13-14
• 1.2.2 类黄酮的主要功能14-16
• 1.2.3 类黄酮在植物体内的生物合成途径16-18
• 1.3 类黄酮生物合成途径中调控基因研究概述18-22
• 1.4 本研究的目的和意义22-24
• 第二章 海棠类黄酮合成相关转录因子克隆24-52
• 2.1 实验材料24-25
• 2.1.1 植物材料24
• 2.1.2 主要仪器设备24-25
• 2.1.3 主要试剂药品25
• 2.2 实验方法25-32
• 2.2.1 海棠叶片总RNA提取25-26
• 2.2.2 海棠叶片总RNA质量和浓度检测26
• 2.2.3 反转录cDNA第一条链合成26-27
• 2.2.4 基因全长引物设计27
• 2.2.5 PCR扩增与检测27-30
• 2.2.6 基因序列的生物信息学分析30
• 2.2.7 目的基因在‘王族’海棠不同器官中的表达分析30-32
• 2.3 结果与分析32-49
• 2.3.1 海棠叶片总RNA提取与检测32-33
• 2.3.2 反转录cDNA第一条链合成与检测33
• 2.3.3‘王族’海棠MYB10基因的克隆与表达分析33-38
• 2.3.4‘王族’海棠MYB6基因的克隆与表达分析38-41
• 2.3.5‘王族’海棠bHLH基因的克隆与表达分析41-46
• 2.3.6‘王族’海棠WD40基因的克隆与表达分析46-49
• 2.4 讨论49-52
• 第三章 海棠叶片色素分析52-60
• 3.1 实验材料52-53
• 3.1.1 植物材料52-53
• 3.1.2 主要仪器设备53
• 3.1.3 主要试剂药品53
• 3.2 实验方法53-54
• 3.2.1 样品采集与处理53
• 3.2.2 海棠叶片花色苷提取53
• 3.2.3 高效液相色谱仪-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）检测类黄酮含量53-54
• 3.2.4 数据处理54
• 3.3 结果与分析54-58
• 3.4 讨论58-60
• 第四章 海棠叶片类黄酮合成相关基因表达分析60-70
• 4.1 实验材料60
• 4.1.1 植物材料60
• 4.1.2 主要仪器设备60
• 4.1.3 主要试剂药品60
• 4.2 实验方法60-62
• 4.2.1 样品采集与RNA提取60
• 4.2.2 荧光实时定量引物设计60-61
• 4.2.3 荧光实时定量q-PCR分析与数据处理61-62
• 4.3 结果与分析62-66
• 4.3.1 海棠叶片样品RNA提取与引物鉴定62
• 4.3.2 结构基因表达分析62-65
• 4.3.3 转录因子表达分析65-66
• 4.4 讨论66-70
• 第五章 结论70-72
• 参考文献72-81
• 致谢81-82
• 作者简介82

【参考文献】

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