鲇源拟态弧菌的分离鉴定研究

发布时间：2021-01-08 17:55

　　2012年以来,四川各地南方鲇和沟鲇的养殖场常爆发一种以体表出现褪色斑,背部、腹部肌肉出现明显的长方状溃疡灶,臀鳍与尾鳍基部出血为特征的传染病。2012-2014年间,从四川各鲇鱼养殖区自然感染发病的南方鲇和沟鲇体内分离到4株（SCCF03-SCCF06）G-弧形,极生单鞭毛短杆菌。在TSA平板于28℃培养48h,形成表面光滑,边缘整齐,微隆起,乳白色的圆形菌落,在鉴别培养基TCBS上则形成绿色菌落。在光学显微镜下,4分离菌呈G-短杆菌,菌体稍弯,呈弧形或逗点状；电镜下可见菌体极生单鞭毛；生理生化特性与弧菌属细菌极为相似。根据分离菌株的形态学和生理生化特性初步判定其为弧菌（Vibrio sp）; 16SrDNA与gyrB序列分析表明,4分离株16SrDNA序列（KC503057sKC503059、KJ001822、KF907127）与GenBank中V.cholerae 16S rDNA序列同源性最高；而gyrB序列（KC503058、KC503060、KC503054、KF998569）与V. mimicus gyrB序列同源性最高。在以分离菌16SrDNA序列及其GenBank中同... 

【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校

【文章页数】：69 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1. V.mimicus的微生物学特征
        1.1 分类地位
        1.2 形态与大小
        1.3 培养特性
        1.4 生物化学特性
        1.5 抵抗力及药物敏感性试验
        1.6 V.mimicus的感染范围及症状
    2. 致病机制及相关毒力因子
        2.1 粘附素
        2.2 肠毒素
        2.3 溶血素
        2.4 其它致病因子
    3. 诊断与防治
    4. 南方鲇的养殖及常见疾病
        4.1 南方鲇的生物学特性
        4.2 南方鲇的常见疾病
            4.2.1 细菌性疾病
            4.2.2 真菌性疾病
            4.2.3 寄生虫性疾病
    5. 目的及意义
第二章 拟态弧菌的分离鉴定
    1. 材料
        1.1 实验动物
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器设备
    2. 方法
        2.1 病原菌的分离
        2.2 人工感染试验
            2.2.1 V.mimicus的培养和计数
            2.2.2 试验动物的分组及感染方式
        2.3 分离株的鉴定
            2.3.1 分离菌的形态学观察
            2.3.2 生理生化特性鉴定
            2.3.3 16S rRNA和gyrB基因鉴定
            2.3.4 16S rRNA及gyrB基因序列测定及系统发育树构建
            2.3.5 基于弧菌系统发育标志性鉴别基因dnaJ的双重PCR检测
        2.4 南方鲇拟态弧菌自然感染的病理学观察
            2.4.1 临床症状及病理解剖观察
            2.4.2 组织病理学观察
                2.4.2.1 取材
                2.4.2.2 石蜡切片的制备
                2.4.2.3 HE染色
        2.5 药敏性检测
    3. 结果
        3.1 病原菌的分离与人工感染试验
        3.2 分离株的表型特征
            3.2.1 细菌的形态
            3.2.2 生理生化特性
        3.3 16S rRNA基因和gyrB基因PCR扩增与系统发育学分析
        3.4 双重PCR检测
        3.5 南方鲇拟态弧菌自然感染的病理学观察
            3.5.1 临床症状及病理解剖观察
            3.5.2 组织病理学变化
        3.6 药物敏感性试验
    4. 讨论
        4.1 V.mimicus的鉴定
        4.2 V.mimicus感染的临床症状辨析
        4.3 V.mimicus感染的病理损伤特点
        4.4 V.mimicus感染的防治
第三章 鲇源拟态弧菌的生物学特性研究
    1. 材料
        1.1 菌株
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器设备
    2. 方法
        2.1 拟态弧菌基因组DNA提取
        2.2 拟态弧菌毒力基因的检测
            2.2.1 毒力基因引物设计
            2.2.2 各毒力基因PCR扩增程序及条件
        2.3 拟态弧菌溶血素基因（vmh）的克隆与生物信息学分析
            2.3.1 引物设计
            2.3.2 vmh基因的PCR扩增
                2.3.2.1 vmh基因的PCR扩增体系
                2.3.2.2 vmh基因的PCR程序
            2.3.3 vmh基因的T-载体克隆与鉴定
                2.3.3.1 目的DNA片段的回收
                2.3.3.2 感受态细胞DH5α的制备
                2.3.3.3 连接
                2.3.3.4 重组克隆质粒转化感受态细胞DH5α
                2.3.3.5 重组克隆质粒的鉴定
        2.4 拟态弧菌溶血素基因（vmh）的生物信息学分析
    3. 结果
        3.1 毒力基因的检测
        3.2 vmh基因的克隆
            3.2.1 vmh基因的PCR扩增
            3.2.2 PCR产物的单、双酶切鉴定
            3.2.3 重组质粒pMD19-T-vmh的PCR鉴定
        3.3 vmh基因的生物信息学分析
            3.3.1 vmh基因核酸序列的开放阅读狂ORF分析
            3.3.2 vmh基因编码的氨基酸序列的理化特性分析
            3.3.3 vmh基因编码的氨基酸序列的结构域预测
            3.3.4 vmh基因编码的氨基酸序列的多序列比对
            3.3.5 vmh基因编码的氨基酸序列的二级结构预测
            3.3.6 vmh基因编码的氨基酸序列的柔性区域预测
            3.3.7 vnh基因编码的氨基酸序列的表面可及性预测
            3.3.8 vmh基因编码的氨基酸序列的疏水性预测
            3.3.9 vnh基因编码的氨基酸序列的信号肽预测
            3.3.10 vnh基因编码的氨基酸序列的跨膜区预测
            3.3.11 vmh基因编码的氨基酸序列的抗原表位预测
            3.3.12 vmh基因编码的氨基酸翻译后磷酸化和糖基化位点预测
    4. 讨论
        4.1 V.mimicus的毒力基因
        4.2 V.mimicus vmh基因的分子特性分析
        4.3 V.mimicus vmh基因编码的氨基酸序列的抗原表位分析
    5. 结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文



本文编号：2965041